吳 康 屈 蓉 王 剛 薛清華 呂建新 Douglas B.Lowrie 范小勇，△

（1上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心 上海 201508；2溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院 溫州 325035）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是主要由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染所致的傳染性疾病。全世界約有1/4 人口是Mtb攜帶者，TB在單一感染病原菌所致疾病中致死人數(shù)最多。2018 年，全世界TB 新發(fā)病例約有1 000 萬，死亡病例約145 萬。其中中國的TB 病例數(shù)占全世界TB病例數(shù)的9%，排名第二（病例數(shù)第一的國家是印度，占全世界TB 病例數(shù)的27%）［1］。2018 年，全世界約有50 萬利福平抗性TB（其中約78%為多藥抗性TB），其中來自中國的病例數(shù)占14%，排名第二（來自印度的病例數(shù)最多，占27%）［1］。WHO 的“End TB”目標(biāo)是在2035 年減少95%（相比于2015年）的TB 致死病例［2］。

TB 的有效治療依賴于現(xiàn)場的及時(shí)快速診斷。目前，TB 的診斷方法主要有基于疑似患者樣本的顯微鏡觀察、培養(yǎng)和核酸擴(kuò)增的方法［3］；基于疑似患者血液細(xì)胞的抗原特異干擾素γ 釋放試驗(yàn)（interferon-γ release assay，IGRA）［4］；基于疑似患者血清/尿液TB 抗原的直接檢測［5］。其中，基于疑似患者樣本的核酸擴(kuò)增和血清/尿液TB 抗原的直接檢測方法具有現(xiàn)場快速且低成本診斷的潛力。

基于疑似患者樣本的核酸擴(kuò)增方法以PCR 或者恒溫?cái)U(kuò)增為基礎(chǔ)。以PCR 為基礎(chǔ)的方法（比如Xpert Mtb/RIF 及其Ultra/OMNI 版本）所需設(shè)備較復(fù)雜且成本較高，因此適合實(shí)驗(yàn)室檢測而不適合現(xiàn)場檢測［3，6］。以恒溫?cái)U(kuò)增為基礎(chǔ)的方法因?yàn)橹恍枰粋€(gè)恒溫裝置便可實(shí)現(xiàn)核酸樣本的快速擴(kuò)增和檢測，因此便于現(xiàn)場檢測。目前有多個(gè)針對TB 的處于不同開發(fā)階段的恒溫?cái)U(kuò)增方法，比如TB-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（TB-loop-mediated amplification test，TBLAMP）［7］、多交叉置換擴(kuò)增（multiple cross displacement amplification，MCDA）［8］、交叉引物擴(kuò)增（cross-priming amplification，CPA）［9-10］、聚合酶螺旋反應(yīng)（polymerase spiral reaction，PSR）［11-12］。這些方法用兩條或者多條引物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，且所用引物必須包括特殊設(shè)計(jì)的可以折疊成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的引物［13］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)重復(fù)DNA 序列無需用特殊設(shè)計(jì)的可以折疊成特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的引物，僅用其特異常規(guī)引物對便可進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)針對MtbⅡ型分枝桿菌散在重復(fù)單位（mycobacterial interspersed repetitive units，MIRUs）的常規(guī)引物，并測試其檢測Mtb的可能性。

材料和方法

細(xì)菌培養(yǎng)Mtb菌株（包括MtbH37Rv 和Mtb臨床分離株）、卡介苗M.bovisBCG 巴斯德株（BCG pasteur）和恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）mc2155 培養(yǎng)于添加了10%油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶添加劑（oleic acid-albumin-dextrose-catalase enrichment，OADC）、0.5%甘油、0.05%吐溫-80 的Middlebrook 7H9 液體培養(yǎng)液中（美國BD Difco 公司）。單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）EGD-e培養(yǎng)于腦心浸液肉湯液體培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）。大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）Top10 培養(yǎng)于LB 液體或固體培養(yǎng)基。細(xì)菌培養(yǎng)溫度為37 ℃。對于氨芐青霉素抗性E.coli克隆的篩選或培養(yǎng)，氨芐青霉素的終濃度為100 mg/L。

MtbH37Rv 和M.bovisBCG 購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。M.smegmatismc2155 由復(fù)旦大學(xué)分子病毒室高謙教授惠贈(zèng)。Mtb臨床分離株來自于上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心檢驗(yàn)科。Listeria monocytogenesEGD-e 由上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院王恒安教授惠贈(zèng)。E.coliTop10 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

基因組DNA 的提取MtbH37Rv 菌液和Listeria monocytogenesEGD-e 菌液在80 ℃水浴滅活30 min 后用于基因組DNA 的提取。M.bovisBCG 和M.smegmatismc2155 不用滅活處理。后續(xù)基因組DNA 的提取參考文獻(xiàn)［14］。簡單來講，細(xì)菌先用溶菌酶（上海生工生物工程有限公司）和RNase A（美國Thermo Fisher Scientific 公司）在37 ℃消化過夜；之后繼續(xù)加入SDS 和蛋白酶K（上海生工生物工程有限公司）并于56 ℃消化1 h；之后再加入十六烷基三乙基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）并于65 ℃繼續(xù)消化10 min。加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）顛倒混勻，12 400×g離心5 min，取上清（本步驟重復(fù)2 次）?；蚪MDNA 通過異丙醇沉淀，并用70%的乙醇洗滌，最后溶解于TE 緩沖液（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中。

Mtb臨床分離株培養(yǎng)物重懸于PBS 并沸水浴15 min（每隔5 min 顛倒混勻），之后12 000×g離心10 min，收集上清用于恒溫?cái)U(kuò)增的模板。本研究所用其他非結(jié)核分枝桿菌（NTM）基因組DNA 由北京胸科醫(yī)院黃海榮主任惠贈(zèng)。

恒溫?cái)U(kuò)增和PCR恒溫?cái)U(kuò)增所用聚合酶為Bst2.0 WarmStart DNA 聚合酶（簡稱Bst2.0）（美國NEB 公司），并按照其說明書進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。對于實(shí)時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增，需在反應(yīng)體系中另加入0.8×的SYBR Gold 核酸熒光染料（原液為10 000×；美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

PCR 所用聚合酶為PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶（簡稱PrimeSTAR）（日本TaKaRa 公司），并按照其說明書進(jìn)行PCR?；谝飏Ds7-F 和/或rDs7-R 的PCR 所用退火溫度為59 ℃，延伸時(shí)間為10 s，循環(huán)數(shù)為35；對應(yīng)模板rDs7 通過全基因合成并連接入載體pUC57，所得載體被命名為pUC57-rDs7。基于引物Ⅱ_MIRU-F 和/或Ⅱ_MIRU-R 的PCR 所用退火溫度為65 ℃，延伸時(shí)間為10 s，循環(huán)數(shù)為35。引物序列見表1。

DNA 的TA 克隆和測序用AxyPrep PCR Clean-up 試劑盒（美國Axygen 公司）回收恒溫?cái)U(kuò)增的DNA 產(chǎn)物，然后用Taq DNA 聚合酶（日本TaKaRa 公司）并按照其說明書于72 ℃處理10 min，以便在DNA 3'末端添加堿基A。將添加堿基A 的DNA 產(chǎn)物連接入載體pMD19-T（日本TaKaRa 公司）、轉(zhuǎn)化E.coliTop10 感受態(tài)細(xì)胞、藍(lán)白斑篩選、挑取白色克隆測序。測序所用引物為載體通用測序引物，即RV-M 和M13-47。

痰液樣本的收集和處理本研究測試了4 例成年肺結(jié)核患者（pulmonary TB，PTB 組）和4 例成年對照志愿者（Control，Con 組）的痰液樣本（＞3 mL）。PTB 組為痰培養(yǎng)和/或痰涂片陽性、IGRA陽性、HIV 陰性、Xpert Mtb/RIF 陽性。Con 組為痰培養(yǎng)和痰涂片陰性、IGRA 陰性、HIV 陰性、Xpert Mtb/RIF 陰性。收集痰液時(shí)，PTB 組和Con 組均未進(jìn)行抗TB 藥物治療。

痰液分為兩份：一份用于Xpert Mtb/RIF 分析；另一份抽提DNA 用于恒溫?cái)U(kuò)增。DNA 抽提步驟為：痰液標(biāo)本中加入2～3 倍體積的4% NaOH（即4 g/100 mL），37 ℃處理30 min，使之充分液化；取液化的標(biāo)本900 μL，加入1.5 mL 的無菌離心管中，14 500×g離心10 min；棄上清，沉淀中加入1 mL 無菌生理鹽水，振蕩混勻（將沉淀懸浮），14 500×g離心10 min；棄上清，再次以1 mL 生理鹽水洗滌沉淀，14 500×g離心10 min；棄上清，沉淀中加入DNA 提取液（來自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒，德國Qiagen 公司）30 μL，振蕩混勻；37 ℃震蕩儀（杭州奧盛儀器有限公司，TMS-200）1 500 r/min 溫浴10 min 后，100 ℃金屬浴10 min。14 500×g離心10 min，保留上清用于恒溫?cái)U(kuò)增的模板。

結(jié)果

以重復(fù)DNA 序列為模板的基于特異常規(guī)上下游引物的恒溫?cái)U(kuò)增以重復(fù)DNA 序列rDs7 為模板，用其特異常規(guī)上下游引物（即rDs7-F 和rDs7-R）（圖1A 和1B）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（所用DNA 聚合酶為不具有鏈置換能力的PrimeSTAR）時(shí)，所得產(chǎn)物高度彌散（圖1C）。因?yàn)镻rimeSTAR 不具有鏈置換能力，以其進(jìn)行的恒溫（59 ℃或65 ℃）擴(kuò)增無法得到擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1C）。以具有鏈置換能力的DNA 聚合酶Bst2.0 進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增則可以得到高度彌散的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1C）。以rDs7 為模板，用Bst2.0 進(jìn)行的恒溫?cái)U(kuò)增需要上下游常規(guī)引物rDs7-F 和rDs7-R 的同時(shí)參與，且擴(kuò)增具有指數(shù)增長特性（圖1D）。重復(fù)DNA 區(qū)段可用其特異常規(guī)上下游引物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。

圖1 以重復(fù)DNA 序列為模板的恒溫?cái)U(kuò)增Fig 1 Isothermal amplification using repetitive DNA as template

以重復(fù)DNA 序列為模板的基于特異常規(guī)上下游引物的恒溫?cái)U(kuò)增原理對于常規(guī)引物便可實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增重復(fù)DNA 序列，其具體機(jī)制可以解釋為（以rDS7 的恒溫?cái)U(kuò)增為例）：（1）因?yàn)橐飏Ds7-F 和rDs7-R 在rDs 各有7 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖1A 和1B），因此引物rDs7-F/rDs7-R 首先可以擴(kuò)增出49 個(gè)不同的DNA 片段，長度可能是108、216、324、432、540、648或756 bp；（2）所擴(kuò)增的49 個(gè)不同的DNA 片段彼此高度同源，其可以扮演彼此的模板和/或引物，再加之rDs7-F/rDs7-R 的持續(xù)參與，之后會(huì)恒溫?cái)U(kuò)增出更加復(fù)雜多樣、彼此高度同源、不同長度的DNA 產(chǎn)物；（3）擴(kuò)增反應(yīng)不斷重復(fù)類似第（1）和第（2）步的反應(yīng)（圖2）。

圖2 重復(fù)DNA 序列rDs7 可能的恒溫?cái)U(kuò)增機(jī)制Fig 2 Proposed mechanism of isothermal amplification on repetitive rDs7

Mtb H37Rv Ⅱ型MIRUs 為模板的恒溫?cái)U(kuò)增MIRUs 是散布于Mtb復(fù)合物基因組的串聯(lián)重復(fù)DNA 序列，其單個(gè)重復(fù)DNA 序列長度一般為40～100 bp。根據(jù)序列特征，MIRUs 可分為Ⅰ型、Ⅱ型、和Ⅲ型。MtbH37Rv 基因組共有41 個(gè)MIRUs 位點(diǎn)，其中含有Ⅱ型MIRUs 的位點(diǎn)數(shù)最多（22 個(gè)），而含有Ⅰ型MIRUs 的位點(diǎn)數(shù)為8 個(gè)，含有Ⅲ型MIRUs的位點(diǎn)數(shù)為16 個(gè)。同一位點(diǎn)可能同時(shí)出現(xiàn)兩種不同類型的MIRUs［15-16］。鑒于重復(fù)DNA 序列可用其特異常規(guī)引物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增（圖1），同時(shí)因?yàn)镸tb基因組中含有MIRUs，且含有Ⅱ型MIRUs 的位點(diǎn)數(shù)最多（22 個(gè)），因此我們設(shè)計(jì)了針對Ⅱ型MIRUs保守序列［15］的上下游特異常規(guī)引物，即Ⅱ_MIRU-F和Ⅱ_MIRU-R（引物序列見表1），并以H37Rv 基因組DNA 為模板進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增和PCR。

如圖3A 所示，和rDs7 的結(jié)果相似（圖1C），以H37Rv 基因組DNA 為模板，用Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R 進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增可以得到擴(kuò)增產(chǎn)物；用Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R 進(jìn)行PCR 亦可得到PCR 產(chǎn)物。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，和rDs7 的結(jié)果不同（圖1D），以H37Rv 基因組DNA 為模板，單用Ⅱ_MIRU-F 進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增亦可得到擴(kuò)增產(chǎn)物，且其擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量高于Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R 恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量；單用Ⅱ_MIRU-R 進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增無法得到擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3B）。將Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R 或Ⅱ_MIRU-F的恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物分別克隆/測序。對于Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R 的恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，29 個(gè)單克隆中有22 個(gè)單克隆可成功測序，其中一個(gè)代表性克隆的測序結(jié)果展示于圖3C。對于Ⅱ_MIRU-F 的恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，33 個(gè)單克隆中僅有1 個(gè)單克隆可成功測序，其測序結(jié)果展示于圖3D。對于克隆無法成功測序，其原因可能為所擴(kuò)增DNA 產(chǎn)物的高級(jí)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜且穩(wěn)定所致。從圖3D 可知，Ⅱ_MIRU-F 在該序列的5’和3’各有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，且方向相反，即Ⅱ_MIRU-F 同時(shí)扮演了上游引物和下游引物。綜上所述，MtbH37Rv Ⅱ型MIRUs 可用其特異常規(guī)引物Ⅱ_MIRUF/Ⅱ_MIRU-R 或者Ⅱ_MIRU-F 進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。

圖3 針對Mtb H37Rv Ⅱ型MIRUs 的恒溫?cái)U(kuò)增Fig 3 Isothermal amplification targeting type ⅡMIRUs of Mtb H37Rv

Ⅱ型MIRUs 特異常規(guī)引物的恒溫?cái)U(kuò)增特異性分析鑒于用常規(guī)引物Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R 或者Ⅱ_MIRU-F 可以恒溫?cái)U(kuò)增MtbH37Rv（圖3B），我們進(jìn)一步測試其對其他菌株的恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果。如圖4A 所示，引物Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R 不能恒溫?cái)U(kuò)增非分枝桿菌菌株Listeria monocytogenesEGD-e，而能恒溫?cái)U(kuò)增非結(jié)核分枝桿菌M.smegmatismc2155和Mtb復(fù)合物菌株M.bovisBCG；Ⅱ_MIRU-F 則不能恒溫?cái)U(kuò)增這3 種菌株，而只能特異地?cái)U(kuò)增MtbH37Rv。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Ⅱ_MIRU-F 亦不能恒溫?cái)U(kuò)增其他多個(gè)非分枝桿菌菌株（圖4B）。對20 個(gè)非結(jié)核分枝桿菌的恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果表明，除MtbH37Rv外，Ⅱ_MIRU-F 只能恒溫?cái)U(kuò)增M.intracellulare和M.gordonae，而不能恒溫?cái)U(kuò)增其他18 個(gè)非結(jié)核分枝桿菌（圖4C）。Ⅱ_MIRU-F 亦不能恒溫?cái)U(kuò)增所測試的其他3 個(gè)Mtb復(fù)合物菌株（即M.microti、M.africanum、和M.bovis）。綜上所述，相比于引物Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRU-R，引物Ⅱ_MIRU-F 具有很強(qiáng)的特異恒溫?cái)U(kuò)增MtbH37Rv 的能力。

Ⅱ型MIRUs 特異常規(guī)引物Ⅱ_MIRU-F 能夠擴(kuò)增其他Mtb 臨床分離株鑒于Ⅱ_MIRU-F 具有很強(qiáng)的特異擴(kuò)增MtbH37Rv 的能力（圖4），我們進(jìn)一步測試Ⅱ_MIRU-F 是否能夠擴(kuò)增Mtb臨床分離株。如圖5 所示，Ⅱ_MIRU-F 可以恒溫?cái)U(kuò)增所測試的20 個(gè)Mtb臨床分離株。表明Ⅱ_MIRU-F 可以通用于恒溫?cái)U(kuò)增Mtb菌株。

圖4 Ⅱ_MIRU-F 和/或Ⅱ_MIRU-R 針對其他菌株的恒溫?cái)U(kuò)增Fig 4 Isothermal amplification targeting other bacteria strains using Ⅱ_MIRU-F and/or Ⅱ_MIRU-R

Ⅱ型MIRUs 特異常規(guī)引物Ⅱ_MIRU-F 恒溫?cái)U(kuò)增的檢測下限分析由圖6 可知，當(dāng)恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)間為1 h 時(shí)，Ⅱ_MIRU-F 不能成功擴(kuò)增所測濃度的MtbH37Rv 基因組DNA；當(dāng)恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)間為2 h 時(shí)，Ⅱ_MIRU-F 可成功擴(kuò)增終濃度為0.4 ng/μL 的MtbH37Rv 基因組DNA；當(dāng)恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)間延長至3 h 時(shí)，Ⅱ_MIRU-F 可進(jìn)一步成功擴(kuò)增終濃度為40 pg/μL 的MtbH37Rv 基因組DNA。

Ⅱ型MIRUs 特異常規(guī)引物Ⅱ_MIRU-F 對于痰液樣本的恒溫?cái)U(kuò)增最后我們測試Ⅱ_MIRU-F 是否可以從痰液中特異檢出Mtb。如表2 所示，和Xpert Mtb/RIF 的結(jié)果一致，Ⅱ_MIRU-F 在恒溫?cái)U(kuò)增1、2、3 h 后都可成功擴(kuò)增PTB 患者的痰液樣本。進(jìn)一步用另外30 個(gè)PTB 患者（同時(shí)為Xpert Mtb/RIF 陽性）樣本的擴(kuò)增（3 h）發(fā)現(xiàn)，其中24 個(gè)樣本亦可成功擴(kuò)增（數(shù)據(jù)未展示）。但是當(dāng)用Ⅱ_MIRU-F恒溫?cái)U(kuò)增非TB 志愿者痰液樣本時(shí)，和Xpert Mtb/RIF 的結(jié)果不同，Ⅱ_MIRU-F 在恒溫?cái)U(kuò)增1、2、3 h后亦能成功擴(kuò)增非TB 志愿者的痰液樣本（表2）。對另外26 個(gè)非TB 志愿者痰液（同時(shí)為Xpert Mtb/RIF 陰性）樣本進(jìn)行擴(kuò)增（3 h）發(fā)現(xiàn)，其中有15 個(gè)樣本亦被成功擴(kuò)增（數(shù)據(jù)未展示）。這些結(jié)果表明，Ⅱ_MIRU-F 不能特異地從PTB 患者的痰液中特異地?cái)U(kuò)增Mtb。

圖5 Ⅱ_MIRU-F 針對Mtb 臨床分離株的恒溫?cái)U(kuò)增Fig 5 Isothermal amplification targeting Mtb clinical isolates using Ⅱ_MIRU-F

圖6 Ⅱ型MIRUs 特異常規(guī)引物Ⅱ_MIRU-F 對于梯度稀釋Mtb H37Rv 基因組DNA 的恒溫?cái)U(kuò)增Fig 6 Isothermal amplification targeting serial diluted Mtb H37Rv genomic DNA using type ⅡMIRU-specific ordinary primer Ⅱ_MIRU-F

表2 Ⅱ型MIRUs 特異常規(guī)引物Ⅱ_MIRU-F 對于痰液樣本的恒溫?cái)U(kuò)增Tab 2 Isothermal amplification targeting sputum samples using type ⅡMIRU-specific ordinary primer Ⅱ_MIRU-F

討論

恒溫?cái)U(kuò)增方法多種多樣［13，17］，其中主要的方法有依賴核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)（nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）［18］、依賴解鏈酶的擴(kuò)增反應(yīng)（helicase dependent amplification，HDA）［19］、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［7，20］、鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)（strand displacement amplification，SDA）［21］和重組酶聚合酶擴(kuò) 增 （recombinase polymerase amplification，RPA）［22］。這些方法的主要特征是反應(yīng)體系中含有鏈置換活性的核酸聚合酶和特殊設(shè)計(jì)的引物（結(jié)合到模板DNA 后便于折疊成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，便于后續(xù)的恒溫?cái)U(kuò)增）［13］。這些方法理論上可以恒溫?cái)U(kuò)增任何DNA 靶標(biāo)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)合具有鏈置換活性的DNA 聚合酶（即Bst2.0）和常規(guī)引物（即引物無需結(jié)合到模板DNA 后折疊成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)）即可實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)恒溫?cái)U(kuò)增重復(fù)DNA 序列（圖1 和圖3）。本研究豐富了恒溫?cái)U(kuò)增的范疇，即對于重復(fù)DNA 序列的擴(kuò)增，使用其特異的常規(guī)引物（同時(shí)結(jié)合具有鏈置換活性的DNA 聚合酶）便可實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增。本研究所述方法只能靶向恒溫?cái)U(kuò)增重復(fù)DNA 序列，而不能靶向恒溫?cái)U(kuò)增非重復(fù)DNA 序列。

Ⅰ型MIRUs 的長度約為77 bp，Ⅱ型MIRUs 由Ⅰ型MIRUs 在其3’端缺失24 bp 而成；Ⅲ型MIRUs由Ⅰ型MIRUs 在其5’端缺失15 bp 而成［15-16］，因此Ⅱ_MIRU-F 亦可以與Ⅰ型MIRUs 互補(bǔ)配對，Ⅱ_MIRU-R 亦可以與Ⅰ型和Ⅲ型MIRUs 互補(bǔ)配對。也就是說，引物對Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ-MIRU-R 理論上可以同時(shí)擴(kuò)增Ⅰ型和Ⅱ型MIRUs，而不能擴(kuò)增Ⅲ型MIRUs。

基于rDs7 的恒溫?cái)U(kuò)增發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上下游引物同時(shí)使用時(shí)才可成功擴(kuò)增，而單獨(dú)使用上游或者下游引物時(shí)則不能成功擴(kuò)增（圖1D）。基于Ⅱ型MIRUs 的恒溫?cái)U(kuò)增發(fā)現(xiàn)，除了同時(shí)使用上下游引物，單獨(dú)使用上游引物Ⅱ_MIRU-F 亦可成功擴(kuò)增，而單獨(dú)使用下游引物Ⅱ_MIRU-R 則不能成功擴(kuò)增（圖3B）。對單獨(dú)使用Ⅱ_MIRU-F 的擴(kuò)增產(chǎn)物的測序發(fā)現(xiàn)，Ⅱ_MIRU-F 既扮演了上游引物，又扮演了下游引物（圖3D）。另外，在MtbH37Rv 基因組有22 個(gè)包含Ⅱ型MIRUs 的位點(diǎn)，其中有7 個(gè)位點(diǎn)在基因組反向排列，因此正向和反向Ⅱ型MIRUs 一起可以滿足Ⅱ_MIRU-F 既扮演上游引物又扮演下游引物［15］?；趓Ds7 和Ⅱ型MIRUs 的恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果是一致的，即需要上下游引物的同時(shí)參與。

MtbH37Rv 基因組中含有41 個(gè)MIRUs 位點(diǎn)［15］。這41 個(gè)MIRUs 位點(diǎn)亦存在于來自世界不同地域（比如摩洛哥、埃及、俄羅斯、阿曼、巴西、塔希提、巴黎）的25 個(gè)Mtb臨床分離株，其中12 個(gè)位點(diǎn)具有MIRU 拷貝數(shù)多態(tài)性，而其他29 個(gè)位點(diǎn)不具有MIRU 拷貝數(shù)多態(tài)性［15］，因此，MIRUs 廣泛存在于Mtb。本研究中，Ⅱ_MIRU-F 能夠成功恒溫?cái)U(kuò)增所測試的20 個(gè)Mtb臨床分離株的DNA（圖5）。

恒溫?cái)U(kuò)增方法針對靶標(biāo)核酸的檢測下限至關(guān)重要。以一個(gè)針對MtbIS6110 的恒溫?cái)U(kuò)增方法（即PSR）為例，反應(yīng)50 min 的檢測下限可低至0.92 pg/μL［12］。相比于引物Ⅱ_MIRU-F/Ⅱ_MIRUR，引物Ⅱ_MIRU-F 能夠更加特異地檢測Mtb，而不能檢測其他菌株（圖4、圖5）。恒溫?cái)U(kuò)增2 h，Ⅱ_MIRU-F 可檢出低至0.4 ng/μL 的MtbH37Rv 基因組DNA；恒溫?cái)U(kuò)增3 h，Ⅱ_MIRU-F 可檢出低至40 pg/μL 的MtbH37Rv 基因組DNA（圖6）。因此Ⅱ_MIRU-F 對靶標(biāo)核酸的檢測下限明顯偏高，且擴(kuò)增時(shí)間較長。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用Ⅱ_MIRU-F 檢測痰液樣本時(shí)，和Xper Mtb/RIF 結(jié)果相比，雖然Ⅱ_MIRU-F 可以檢測出PTB 患者，但是其亦在對照志愿者的痰液擴(kuò)增出核酸產(chǎn)物（表2）?；冖騙MIRU-F 較高的檢測下限（圖6）、較長的擴(kuò)增時(shí)間及其低特異性（表2），判斷其不適合用于臨床檢測痰液樣本。

綜上所述，相比于其他恒溫?cái)U(kuò)增方法需要特殊設(shè)計(jì)的引物，我們發(fā)現(xiàn)常規(guī)引物可以恒溫?cái)U(kuò)增重復(fù)DNA 區(qū)段；設(shè)計(jì)的針對MtbⅡ型MIRUs 的常規(guī)引物不適合用于臨床檢測痰液樣本。