劉飛雨，任怡靜，金 欣，郭美琪，李 敏，潘麗娜*

1天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2天津師范大學(xué)天津市動(dòng)物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387

美國(guó)白蛾Hyphantriacunea(Drury)屬鱗翅目燈蛾科，是入侵性、國(guó)際性檢疫害蟲，主要通過(guò)幼蟲取食葉片危害林木、果樹(shù)、花卉及園藝作物，給我國(guó)農(nóng)林生產(chǎn)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失(盧修亮等，2020)。目前在美國(guó)白蛾集中暴發(fā)區(qū)，主要采用航空施藥防治為主，地面防治為輔的防治策略，可基本控制美國(guó)白蛾疫情，但化學(xué)農(nóng)藥會(huì)帶來(lái)一系列環(huán)境、生態(tài)、食品安全問(wèn)題等。探索無(wú)公害、長(zhǎng)效的防治技術(shù)對(duì)于美國(guó)白蛾的可持續(xù)防控有重要意義。白蛾周氏嚙小蜂Chouioiacunea(Yang)是楊忠岐(2018)發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)美國(guó)白蛾有顯著防治效果的蛹寄生蜂，其寄生率可達(dá)92.2%。化學(xué)防治與生物防治相結(jié)合是害蟲綜合防治的重要策略，而常見(jiàn)殺蟲劑對(duì)白蛾周氏嚙小蜂的安全性評(píng)價(jià)甚少。

多殺菌素是具有殺蟲效應(yīng)的土壤細(xì)菌刺糖多孢菌Saccharopolysporaspinosa有氧發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物，相對(duì)于有機(jī)磷殺蟲劑，多殺菌素是一種低毒、對(duì)環(huán)境友好的廣譜殺蟲劑(Galm & Sparks，2015；Kirst，2010)，對(duì)于多種農(nóng)業(yè)害蟲有良好的殺蟲效應(yīng)(Morales-olaisetal.，2020)。與高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺等常用殺蟲劑類似，多殺菌素施藥后會(huì)長(zhǎng)時(shí)間存留在植物葉片上，且對(duì)天敵昆蟲如捕食性天敵齒爪盲蝽Deraeocorisbrevis、寄生性天敵玉米螟卵赤眼蜂TrichogrammachilonisIshii有明顯的觸殺效應(yīng)，同時(shí)顯著影響寄生天敵的寄生性(Amarasekare & Shearer,2020; Khan,2019)。

多殺菌素可通過(guò)體表滲透進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，且一旦進(jìn)入將無(wú)法代謝排出。多殺菌素的殺蟲效應(yīng)主要是通過(guò)變構(gòu)拮抗煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR，一種經(jīng)遞質(zhì)配體門控的離子通道蛋白)，刺激昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致非功能性肌肉收縮、震顫、麻痹而死亡(Sparksetal.，2012)。在田間及實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的抗性害蟲品系多發(fā)生nAChR alpha6蛋白失活。應(yīng)用CRISPER技術(shù)敲除2個(gè)nAChR 亞基(Haalpha6和Haalpha7)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，敲除Haalpha6的棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHubner及小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Linnaeus)對(duì)多殺菌素的抗性均顯著提高(Wangetal.,2020a，2020b)。

評(píng)估殺蟲劑對(duì)天敵昆蟲的風(fēng)險(xiǎn)程度，可為制定綜合害蟲防治和保護(hù)天敵昆蟲的措施提供理論基礎(chǔ)。因此，本研究采用藥膜法，通過(guò)不同濃度多殺菌素處理，檢測(cè)其對(duì)美國(guó)白蛾寄生性天敵周氏嚙小蜂的安全性，并以亞致死濃度多殺菌素脅迫刺激白蛾周氏嚙小蜂，測(cè)定其谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase, GSTs)、羧酸酯酶(carboxyesterase, CarE)2種主要解毒酶及乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AchE)的活性，旨在為全面闡明白蛾周氏嚙小蜂對(duì)多殺菌素的解毒機(jī)制、白蛾周氏嚙小蜂的抗藥性及綜合防控美國(guó)白蛾提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 白蛾周氏嚙小蜂由漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心惠贈(zèng)，在本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：人工氣候箱(PQX-350H)溫度25 ℃，相對(duì)濕度75%，光周期13L∶11D。自接種于柞蠶(AntheraeapernyiGuerin-Meneville)蛹后，培養(yǎng)14 d獲得老熟幼蟲，培養(yǎng)20 d獲得成蟲。

1.1.2 藥劑及儀器 乙基多殺菌素懸浮劑(有效成分含量3%)，美國(guó)陶氏益農(nóng)公司(田間使用濃度24～40 mg·L-1)。AchE活性測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：BC2025)、GSTs活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：BC0355)、CarE活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：BC0840)，北京索萊寶科技有限公司。手持式電動(dòng)組織研磨器，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司。多功能酶標(biāo)儀(Infinite 200)，瑞士帝肯(Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 室內(nèi)毒力評(píng)估及安全性評(píng)價(jià) 室內(nèi)毒力評(píng)估采用藥膜法，將60 g·L-1多殺菌素用清水稀釋，配制成有效濃度為0、5、10、15、20、25 mg·L-1的藥液。在干凈的50 mL廣口錐形瓶中倒?jié)M藥液，靜置5 min，倒出管內(nèi)藥液，自然晾干，使藥液在管壁上均勻形成藥膜，接入羽化后12 h內(nèi)成蜂50頭，瓶口用120目網(wǎng)布封緊，分別于1、2、4、6和24 h后檢查統(tǒng)計(jì)瓶中白蛾周氏嚙小蜂死亡數(shù)量。初步確定多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂的毒力，并計(jì)算多殺菌素使白蛾周氏嚙小蜂死亡10%、20%、30%、50%的劑量(LC10、LC20、LC30、LC50)。

農(nóng)藥對(duì)白蛾周氏嚙小蜂的毒性評(píng)價(jià)目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，白蛾周氏嚙小蜂與赤眼蜂Trichogrammatidspp.同為寄生性天敵昆蟲，可參照赤眼蜂進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局等，2014)，赤眼蜂的安全性評(píng)價(jià)采用安全系數(shù)法：極高風(fēng)險(xiǎn)(安全系數(shù)≤0.05)；高風(fēng)險(xiǎn)(0.05<安全系數(shù)≤0.5)；中風(fēng)險(xiǎn)(0.5<安全系數(shù)≤5)；低風(fēng)險(xiǎn)(安全系數(shù)>5)。因此，多殺菌素的安全系數(shù)為白蛾周氏嚙小蜂的半致死濃度LC50與該藥的田間推薦施用濃度的比值，即：安全系數(shù)=毒性LC50/田間實(shí)際使用濃度。

1.2.2 酶活性測(cè)定 分別取不同亞致死濃度0、LC10(5.6 mg·L-1)、LC20(7.3 mg·L-1)、LC30(8.8 mg·L-1)、LC50(11.9 mg·L-1)處理后存活的幼蟲進(jìn)行相關(guān)酶活性的測(cè)定。取白蛾周氏嚙小蜂150只(約0.025 g)，根據(jù)試劑盒推薦比例加入試劑，冰浴中整體研磨勻漿，勻漿液12000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液作為CarE、GSTs和AchE活性測(cè)定的酶源。CarE、GSTs和AchE活性測(cè)定參照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，每處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件計(jì)算毒力回歸方程和致死中濃度，采用Excel 2016對(duì)酶活力測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂的毒力評(píng)估及安全性評(píng)價(jià)

多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂無(wú)短期(1 h)觸殺作用，但隨施藥時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)小蜂的毒殺作用增強(qiáng)，25 mg·L-1多殺菌素施藥2 h后，可誘導(dǎo)18.67%小蜂個(gè)體死亡。施藥4 h后，不同濃度多殺菌素對(duì)小蜂的毒殺作用差異最明顯，低濃度(5 mg·L-1)多殺菌素可誘導(dǎo)11.33%小蜂死亡，而中、高濃度多殺菌素(≥15 mg·L-1)可誘導(dǎo)77.33%～88.00%個(gè)體死亡。施藥6 h后，高濃度多殺菌素(≥20 mg·L-1)可造成幾乎全部個(gè)體死亡。施藥24 h后，各施藥濃度均可引起超過(guò)96.00%的小蜂死亡，說(shuō)明多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂有顯著毒殺作用(表1)。

表1 不同濃度多殺菌素處理后白蛾周氏嚙小蜂成蜂存活率

進(jìn)一步觸殺毒力分析表明，施藥2 h，LC50值為52.70 mg·L-1，依據(jù)田間使用濃度24 mg·L-1計(jì)算，安全系數(shù)為2.20，屬中風(fēng)險(xiǎn)性農(nóng)藥。而施藥4和6 h后，LC50值分別為12.06和7.44 mg·L-1，安全系數(shù)為0.50和0.31，屬高風(fēng)險(xiǎn)性農(nóng)藥(表2)。說(shuō)明雖然多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂觸殺作用不強(qiáng)，但仍具明顯毒殺作用，屬于高風(fēng)險(xiǎn)性農(nóng)藥，在白蛾周氏嚙小蜂生防區(qū)域需慎用。

表2 多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂成蜂的觸殺毒力

2.2 多殺菌素脅迫對(duì)白蛾周氏嚙小蜂酶活性的影響

2.2.1 多殺菌素脅迫對(duì)白蛾周氏嚙小蜂AchE活性的影響 多殺菌素通過(guò)拮抗煙堿型乙酰膽堿受體，作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，從而對(duì)鱗翅目、纓翅目和雙翅目害蟲具有良好的防治作用(王燕燕等，2015)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨多殺菌素濃度提高，白蛾周氏嚙小蜂AchE活性無(wú)明顯變化，當(dāng)多殺菌素濃度為L(zhǎng)C50時(shí)，AchE活性為1.3 U·mg-1，白蛾周氏嚙小蜂AchE活性僅可達(dá)對(duì)照的1.3倍，即高濃度多殺菌素處理會(huì)引起AchE活性提高，但無(wú)法形成其對(duì)藥物的抗性作用(圖1)。

2.2.2 多殺菌素脅迫對(duì)白蛾周氏嚙小蜂GSTs、CarE活性的影響 本研究對(duì)白蛾周氏嚙小蜂2種解毒酶(GSTs及CarE)活性變化的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂GSTs活性誘導(dǎo)作用呈劑量效應(yīng)。隨著多殺菌素濃度的升高，GSTs活性變化由緩慢到顯著上升，在高濃度(11.9mg·L-1)時(shí)活性被顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明GSTs主要在高濃度多殺菌素的解毒代謝中發(fā)揮重要作用。各亞致死濃度的多殺菌素處理對(duì)CarE活性均有顯著的誘導(dǎo)作用，高濃度(11.9 mg·L-1)時(shí)CarE活性為4.5 U·mg-1，誘導(dǎo)作用達(dá)到最強(qiáng)，說(shuō)明多殺菌素在試驗(yàn)范圍內(nèi)均能顯著增強(qiáng)CarE活性，CarE在白蛾周氏嚙小蜂解毒機(jī)制中發(fā)揮重要作用(圖1)。

圖1 多殺菌素脅迫對(duì)白蛾周氏嚙小蜂AchE、GSTs和CarE活性的影響

3 討論

在化學(xué)防治中，殺蟲劑亞致死效應(yīng)對(duì)捕食性天敵的抗藥性研究具有重要意義。捕食性天敵的抗藥性機(jī)理主要有2種：靶標(biāo)酶敏感性降低和解毒酶活性升高(楊慧等,2020)。研究表明，棉鈴蟲的GSTs與有機(jī)磷-毒死蜱、敵敵畏和擬除蟲菊酯-氯氰菊酯供試農(nóng)藥具有較強(qiáng)的親和力，其體內(nèi)的GSTs活性和基因表達(dá)的上調(diào)具有劑量效應(yīng)，且GSTs和酯酶的解毒機(jī)制參與了殺蟲劑抗性的產(chǎn)生(Wangetal.，2016)，促進(jìn)了昆蟲對(duì)有害物質(zhì)的解毒代謝(Labadeetal.,2018)。水解酶類羧酸酯酶的解毒代謝能力增強(qiáng)是抗藥性產(chǎn)生的重要機(jī)制，研究表明棉蚜AphisgossypiiGlover的羧酸酯酶活性的變化與抗藥性程度呈正相關(guān)關(guān)系(盧芙萍等，2006)。本研究中，CarE的活性隨著供試藥劑濃度的增加而上升，推測(cè)白蛾周氏嚙小蜂中CarE與抗藥性程度相關(guān)，CarE可能是誘發(fā)白蛾周氏嚙小蜂對(duì)多殺菌素產(chǎn)生抗藥性的一個(gè)潛在因素。靶標(biāo)酶AchE的敏感性變化與昆蟲的抗藥性產(chǎn)生密切相關(guān)，多殺菌素類殺蟲劑作用靶標(biāo)煙堿型乙酰膽堿受體，使昆蟲體內(nèi)的AchE快速水解興奮型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，阻礙其神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間的傳遞進(jìn)而影響神經(jīng)沖動(dòng)的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致昆蟲出現(xiàn)異常肌肉興奮甚至中毒死亡(孟琳琳等,2010)。研究表明，草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E Smith)體內(nèi)AchE的活性隨乙基多殺菌素劑量的增加而增加，對(duì)蟲體產(chǎn)生其抗藥性起著重要作用(高祖鵬等,2020)。本研究中，AchE的活性與供試藥劑存在劑量效應(yīng)，在高濃度AchE活性較高，推測(cè)其在高濃度藥劑下發(fā)揮顯著作用，增強(qiáng)抗藥性的產(chǎn)生。

本研究表明，多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂存在一定的毒害作用，且施藥時(shí)間較短時(shí)多殺菌素對(duì)白蛾周氏嚙小蜂具有中風(fēng)險(xiǎn)性，施藥時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)有高風(fēng)險(xiǎn)性。推測(cè)利用多殺菌素防治美國(guó)白蛾會(huì)對(duì)白蛾周氏嚙小蜂具有顯著的觸殺作用，因此，在使用多殺菌素防治美國(guó)白蛾時(shí)，應(yīng)注意保護(hù)白蛾周氏嚙小蜂。