李夢月，張 某，魯武峰，蘭明先，易 璟，李成學(xué)，吳國星

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南 昆明 650100

抗生素是一種能殺滅或抑制微生物生長、預(yù)防和治療人和動物感染的物質(zhì)，作為一類廣譜性抗菌藥物在人畜疾病防治和治療方面做出了重大貢獻，但抗生素?zé)o法被人畜完全吸收，大部分以母體或代謝物子體的形式被排出體外，然后進入環(huán)境(Edmond & Willis,2019)。環(huán)境中抗生素的殘留及其抗性基因和病原菌的出現(xiàn)和流行已成為嚴(yán)重的全球衛(wèi)生問題(Dongetal.,2019; Hernándezetal.,2019)。目前，抗生素類化合物已成為環(huán)境中廣泛存在的一類新興污染物(葛林科等,2015)。四環(huán)素作為由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素已成為我國用量最大的抗生素種類之一，已經(jīng)引起了一系列的土壤污染、水體污染及環(huán)境和食殘留問題(楊曉芳等,2014; 左儒楠等,2018; Liuetal.,2019)。植物修復(fù)技術(shù)作為去除四環(huán)素污染的方法已經(jīng)被廣泛研究與應(yīng)用，向日葵HelianthusannuusL.、大漂PistiastratiotesL.、鳳眼蓮Eichhorniacrassipes(Mart.)Solms、鷹嘴豆CicerarietinumL.、香根草Vetiveriazizanioides(L.)Nash、蘿卜RaphanussativusLinn.、美人蕉CannaindicaL.、皇竹草PennisetumsineseRoxb、梭魚草PontederiacordataL.、風(fēng)車草CyperusalternifoliusL.對四環(huán)素具有修復(fù)去除效果(陳小潔等,2012; 周品成等,2019; Gahlawat & Gauba,2016; Gujarathietal.,2005; Makhijanietal.,2014a; Senguptaetal.,2016)。不同植物對四環(huán)素具有不同的去除效果，被用于修復(fù)的植物通常具有生長速度快、生物量產(chǎn)率高、根系大而密、降解酶水平高、可收獲組織中積累大量污染物的能力強、耐寒、有競爭力、耐污染等特性(Makhijanietal.,2014)。

紫莖澤蘭Ageratinaadenophora(Spreng.)R.M.King et H.Rob.作為多年生雜草，具有生長周期長、繁殖力強、易栽培、較強表型可塑性和局域適應(yīng)性且不宜被動物取食的優(yōu)勢(強勝,2008)，倘若它對四環(huán)素具有良好的吸收累積特性，將有望被用于四環(huán)素污染修復(fù)，使紫莖澤蘭變廢為寶，實現(xiàn)“以用促防”的雜草防治理念。至今，關(guān)于紫莖澤蘭吸收累積四環(huán)素的研究還未有報道。為此，本研究采用水培方法分析紫莖澤蘭對四環(huán)素的吸收累積特性，旨在為利用紫莖澤蘭修復(fù)四環(huán)素污染提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與溶液

氯鹽酸四環(huán)素(Tetracycline HCL，TC)：Biotopped公司產(chǎn)品，純度99%，分子式(C22H24N2O8·HCL)；甲醇、甲酸為色譜純；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸氫二鈉、檸檬酸、Na2EDTA、NaOH、濃鹽酸為分析純；純凈水(18 Ω)；大量元素水溶肥料(四川什邡德美實業(yè)有限公司和美國PLANTA肥料公司聯(lián)合制造)。

1.2 供試植物與處理方法

選用成熟飽滿的紫莖澤蘭種子在不含四環(huán)素的營養(yǎng)土內(nèi)進行育苗，待幼苗長至6～10 cm時供試。實驗分別設(shè)10、15、20 mg·L-13種不同四環(huán)素含量水培液(每升水中溶解大量元素水溶肥料1 g)處理，每個處理15～18株紫莖澤蘭幼苗，設(shè)6個重復(fù)。實驗條件為溫度(26±2)℃，光照比16∶8 h。7、15、20 d時分別取樣測定四環(huán)素含量。每4～5 d 更換一次培養(yǎng)液以保證四環(huán)素濃度。

1.3 植物體內(nèi)四環(huán)素的提取

處理完成后的紫莖澤蘭幼苗在無菌水中清洗3次，清除吸附在植株表面的四環(huán)素。將各待測植物組織在液氮中研磨成粉末，稱取0.1 g樣品加入1 mL Na2EDTA-McIlvaine緩沖液，渦旋30 s，振蕩10 min后，在4 ℃、12000 r·min-1的條件下離心15 min，取上清液過濾，然后轉(zhuǎn)移到新的離心管中，在4 ℃、≥2000 r·min-1條件下離心10 min，再取500 L上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確量取一定體積的四環(huán)素儲備液，稀釋成5個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品液，分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg·L-1。使用島津LC-20AD超快速液相，各取2 L進樣，測得四環(huán)素峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算R2值。

1.5 液相色譜條件

Shim-pack VP-ODS反相色譜柱(柱：250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)。流動相為甲醇、0.25%甲酸(pH=3.0)，采用梯度洗脫法：0～0.01 min B相體積比占10%，0.01～15 min B相體積比占40%，15 min B相體積比占10%。柱溫30 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長355 nm，進樣量2 μL，流速為1.5 mL·min-1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

富集系數(shù)：水培液-紫莖澤蘭系統(tǒng)的富集系數(shù)=紫莖澤蘭體內(nèi)四環(huán)素濃度/水培液中四環(huán)素濃度。

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理用Spass 15.0和Excel 2007軟件完成，以Duncan′s新復(fù)極差法檢驗對顯著性進行比較和分析，將小于0.05(P<0.05)的概率值視為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素濃度對紫莖澤蘭吸收能力的影響

由圖1可知，紫莖澤蘭能夠吸收水中不同濃度的四環(huán)素，相同處理時間紫莖澤蘭根、莖、葉中的四環(huán)素積累量隨著供試濃度的升高而增加(P<0.05)。當(dāng)處理時間為20 d，處理濃度10 mg·L-1時，根、莖、葉中的四環(huán)素積累濃度分別為(19.88±3.32)、(15.46±4.02)和(8.67±1.32)mg·kg-1；處理濃度15 mg·L-1時，根、莖、葉中的四環(huán)素積累量分別為(32.70±1.89)、(43.27±1.63)和(17.39±2.42)mg·kg-1；處理濃度20 mg·L-1時，根、莖、葉中的四環(huán)素積累量分別為(52.52±5.89)、(59.34±3.86)和(23.19±4.17)mg·kg-1。同時，當(dāng)紫莖澤蘭被處理時間為20 d，處理濃度為20 mg·L-1時，紫莖澤蘭根、莖、葉的生物富集系數(shù)分別為2.6、2.9、1.1，說明根、莖、葉的吸收積累能力存在差異，其中紫莖澤蘭莖對四環(huán)素的吸收積累能力最好(表1)。

表1 四環(huán)素在紫莖澤蘭器官中的富集系數(shù)

2.2 處理時間對紫莖澤蘭吸收能力的影響

由圖1可知，處理時間會影響紫莖澤蘭對水中四環(huán)素的吸收，相同處理濃度紫莖澤蘭根、莖、葉中的四環(huán)素積累量隨著處理時間的增加而升高(P<0.05)。當(dāng)處理濃度為20 mg·L-1，處理時間7 d時，根、莖、葉中的四環(huán)素積累量分別為(16.32±1.02)、(39.98±0.89)和(13.68±3.28)mg·kg-1；處理時間15 d時，根、莖、葉中的四環(huán)素積累量分別為(37.28±4.71)、(44.89±3.46)和(20.78±2.06)mg·kg-1；處理時間20 d時，根、莖、葉中的四環(huán)素積累濃度分別為(52.52±5.89)、(59.34±3.86)和(23.19±4.17)mg·kg-1。

圖1 不同處理條件下紫莖澤蘭對四環(huán)素的吸收特征

3 討論

紫莖澤蘭能夠吸收并累積四環(huán)素，其吸收能力和四環(huán)素濃度及處理時間有關(guān)：四環(huán)素在紫莖澤蘭體內(nèi)的分布和積累隨著其濃度和處理時間的升高而增大。同時，四環(huán)素的物理化學(xué)性質(zhì)和環(huán)境暴露都可能影響紫莖澤蘭對其的富集效果(張圣新等,2018;Topaletal.,2018)。對比發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭不同組織部位的吸收累積能力不同：相較而言，莖的吸收累積能力最強，根的次之，葉的最小。這種差異可能是由于紫莖澤蘭的積累機制較外排機制能力略強導(dǎo)致的(張圣新等,2018; Collins Cetal.,2006)。研究結(jié)果說明,紫莖澤蘭對四環(huán)素具有良好的吸收累積特性，故研究紫莖澤蘭對四環(huán)素的吸收特性有望實現(xiàn)紫莖澤蘭的變廢為寶，達到“以用促防”的雜草防治理念。

植物對環(huán)境中抗生素的吸收與其生長環(huán)境和栽培方式密切相關(guān)(張步迪等,2018；Avisaretal.,2010)。紫莖澤蘭在低洼處、溪邊等水分充足的地方生長旺盛，根系發(fā)達，且在水體中能正常生長。本研究僅通過常用的水培法探究紫莖澤蘭對環(huán)境中四環(huán)素的吸收富集情況，不同栽培方式和土壤性質(zhì)等對紫莖澤蘭對四環(huán)素的吸收富集的差異影響還需進一步研究。

污染物的降解率也可能是決定植物修復(fù)適用性的關(guān)鍵因素(Carvalhoetal.,2014)。有關(guān)入侵雜草紫莖澤蘭對四環(huán)素耐受程度和吸收潛力等方面的內(nèi)容還有待進一步的研究，如紫莖澤蘭對四環(huán)素的吸收是否受作物蒸騰速率的影響，蒸騰速率的增加是否會加速其對四環(huán)素的吸收效率等。此外，植物修復(fù)抗生素污染機制的研究還較少，本研究中吸入紫莖澤蘭中的四環(huán)素或被體內(nèi)代謝，或以原來的形態(tài)留在植物體內(nèi)的情況值得進一步探究。