白蓓蓓，劉偉，王海萍

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266000；2.諸城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 濰坊 262200)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種由細(xì)胞、膽固醇和細(xì)胞外基質(zhì)聚集而導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚和硬化引起的疾病[1- 2]，血源性炎癥因子、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是AS病變的主要組成部分[3]。AS在發(fā)達(dá)國家與發(fā)展中國家發(fā)病率和死亡率呈不斷上升的趨勢，可以導(dǎo)致心肌梗死、缺血性中風(fēng)和外周動(dòng)脈疾病[4]。VSMCs的異常增殖和遷移參與了AS的發(fā)生發(fā)展[5]，有必要針對(duì)VSMCs的異常行為發(fā)展治療AS的有效方法，研發(fā)新的有效的AS標(biāo)志物對(duì)疾病的早期診斷和治療具有重要意義[6]。

微小RNA(miRNAs)是長度為18～24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)(UTRs)相結(jié)合發(fā)揮作用。miRNA在血管壁表達(dá)豐富，可作為多種血管疾病過程中的重要調(diào)控因子[7]。多個(gè)miRNAs被報(bào)道通過調(diào)控VSMCs的增殖、遷移和侵襲參與AS的進(jìn)程， 如miR-21[8]、 miR-133a[9]、miR-665 等。miR-139-5p位于人類染色體11q13.4區(qū)，是一種常見的腫瘤相關(guān)的miRNA。最近的報(bào)道指出miR-139-5p是一種新型的心肌細(xì)胞抗增生性的miRNA，可以通過下調(diào)體外C-Jun的表達(dá)來減輕心肌肥厚[10]。miR-139的過表達(dá)可以調(diào)控多種與心臟缺血再灌注相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)激、代謝、細(xì)胞存活和凋亡等功能[11]。此外，熒光標(biāo)記探針(TaqMan)miR陣列顯示，與急性冠狀動(dòng)脈疾病患者相比，miR-139-5p在穩(wěn)定的冠狀動(dòng)脈疾病患者中異常表達(dá)，參與了血管性能的調(diào)節(jié)作用[12]。雖然miR-139-5p能影響AS的多種常見并發(fā)癥，然而miR-139-5p在AS發(fā)展中的準(zhǔn)確作用和詳細(xì)機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)比miR-139-5p在健康人群和AS患者中的表達(dá)水平，評(píng)估m(xù)iR-139-5p對(duì)AS的診斷價(jià)值，探討miR-139-5p對(duì)AS中VSMCs生物學(xué)行為的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)過青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與研究人員均簽署知情同意書。實(shí)驗(yàn)共招募了190名受試者，包括112例AS患者(AS組)和78名健康志愿者(對(duì)照組)。本研究使用頸總動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度(CIMT)作為AS的診斷標(biāo)準(zhǔn)， CIMT<0.8 mm為非AS狀況，CIMT≥0.8 mm為AS[13]。CIMT值使用ATL HDI 3000超聲系統(tǒng)(Advanced Technology Laboratories, Bothell, WA) 檢測，配備5 MHz線性陣列換能器。記錄所有受試者的人口學(xué)特征和臨床資料，排除有臨床大血管疾病、嚴(yán)重心腦血管疾病(急性心肌梗死、心力衰竭、中風(fēng)等)、糖尿病、癌癥、吸煙、頸部手術(shù)、風(fēng)濕性免疫疾病或有相關(guān)治療史的受試者。每名受試者禁食1晚后采集外周血漿，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人的血管平滑肌細(xì)胞(HVSMCs)(ATCC, USA)用含有10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑為脂質(zhì)體(Lipofectamine) 2000(Invitrogen，USA)，轉(zhuǎn)染載體分別為miR-139-5p 模擬物、miR-139-5p 抑制物及模擬物對(duì)照、抑制劑對(duì)照。轉(zhuǎn)染6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用TRIzol(Invitrogen, USA)試劑提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA和血清RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR green I Master Mix試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)在ABI 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Waltham, USA)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參，miR-139-5p的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt的方法計(jì)算。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長期的HVSMCs細(xì)胞以每孔5×103的數(shù)量接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，每隔24 h進(jìn)行檢測，檢測前向每孔中添加10 μl CCK-8試劑，放培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后放置酶標(biāo)儀上震蕩1 min，檢測490 nm處吸光值的變化。連續(xù)檢測3 d后評(píng)估m(xù)iR-139-5p對(duì)HVSMCs細(xì)胞增殖能力的影響。

1.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行消化，用無血清培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。取200 μl含3×104個(gè)細(xì)胞的懸液添加至Transwell小室的上室，下室添加500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將小室取出，用棉簽將上室中未遷移的細(xì)胞擦拭掉，用4%多聚甲醛固定10 min后，0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，清洗晾干后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)，檢測miR-139-5p對(duì)HVSMCs遷移能力的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0軟件以及GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，采用Student’st檢驗(yàn)和單因素方差分析比較各組間的差異。使用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)評(píng)估連續(xù)變量之間的相關(guān)性。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評(píng)估m(xù)iR-139-5p在AS中的診斷價(jià)值，并計(jì)算曲線下面積(AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料的比較

與對(duì)照組相比，AS組患者的年齡、性別、體重指數(shù)以及總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AS組的C反應(yīng)蛋白(CRP)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組一般資料的比較

2.2 miR-139-5p在兩組血清中表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組相比，AS組血清miR-139-5p的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.001，圖1)。

a 與對(duì)照組比較，P<0.001

2.3 AS患者miR-139-5p的表達(dá)量與CIMT的關(guān)系

AS患者血清miR-139-5p表達(dá)水平與CIMT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.757 9,P<0.001, 圖2)。

圖2 AS患者miR- 139- 5p與CIMT的關(guān)系

2.4 miR-139-5p對(duì)AS患者的診斷價(jià)值

ROC曲線分析顯示，AUC為0.888，靈敏度為86.60%，特異性為84.60%，截?cái)嘀禐?.737 5(圖3)，miR-139-5p對(duì)AS診斷的準(zhǔn)確性較高。

2.5 miR-139-5p對(duì)HVSMCs增殖和遷移的調(diào)控作用

采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miR-139-5p模擬物組中miRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，而miR-139-5p抑制組的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，見圖4A。

采用CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-139-5p對(duì)HVSMCs增殖能力的影響， 結(jié)果顯示，miR-139-5p模擬物組的增殖能力顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，而miR-139-5p 抑制劑組的增殖能力顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，miR-139-5p低表達(dá)能顯著促進(jìn)HVSMCs的增殖能力，見圖4B。采用Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-139-5p對(duì)HVSMCs遷移能力的影響，結(jié)果顯示，miR-139-5p模擬物組的遷移能力顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，而miR-139-5p抑制劑組的遷移能力顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，見圖4C。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-139-5p在AS患者血清中的表達(dá)水平顯著下降，與已有研究[10- 11]的結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-139-5在AS進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要作用。此外，本研究還對(duì)受試者血清CRP的濃度進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明在AS患者中CRP濃度顯著增加。多項(xiàng)研究[14- 17]報(bào)道慢性炎癥參與AS形成的所有階段，包括早期粥樣硬化形成、斑塊的不穩(wěn)定、血栓形成和心血管事件的發(fā)生等。CRP作為炎癥的非特異性標(biāo)志物，是心血管疾病有效的預(yù)示因子和危險(xiǎn)因子。我們的研究結(jié)果證實(shí)AS患者中CRP的濃度與對(duì)照組相比顯著升高，與已有的研究結(jié)果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)AS患者血清中miR-139-5p的表達(dá)水平與CIMT值呈負(fù)相關(guān)。CIMT是美國心臟協(xié)會(huì)和美國心臟病學(xué)會(huì)推薦的一種超聲檢測結(jié)果，因?qū)崟r(shí)、安全、快速、無創(chuàng)等特點(diǎn)，在臨床上被認(rèn)為是亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化的重要指標(biāo)，且CIMT的增加與多種心血管危險(xiǎn)因素有關(guān)。在我們的研究中CIMT值較高的患者血清miR-139-5p的表達(dá)水平降低，兩者呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)本研究還通過ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-139-5p在AS中的診斷價(jià)值，結(jié)果表明miR-139-5p是一種具有高敏感性和特異性的潛在診斷生物標(biāo)志物。miRNA在AS中的診斷價(jià)值已經(jīng)被廣泛研究。在本研究中，miR-139-5p的低表達(dá)被認(rèn)為是AS中的一個(gè)新的潛在生物標(biāo)志物。

我們對(duì)miR-139-5p調(diào)控HVSMCs的體外功能進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明miR-139-5p的過表達(dá)會(huì)顯著抑制HVSMCs的增殖和遷移能力，而降低miR-139-5p的表達(dá)會(huì)顯著的促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移能力。AS發(fā)生的過程與VSMCs異常的增殖和遷移相關(guān)，且多種miRNAs已經(jīng)被報(bào)道參與并調(diào)控AS中VSMCs的功能變化[18]。此結(jié)果與miRNAs可以調(diào)控AS中VSMCs增殖和遷移能力的結(jié)果是一致的，表明miR-139-5p對(duì)HVSMCs的生物學(xué)行為具有抑制作用，這可能是miR-139-5p在AS中作用的潛在機(jī)制。此外，已有報(bào)道[10]證實(shí)miR-139-5p通過靶向調(diào)控C-Jun蛋白進(jìn)一步調(diào)控AS的并發(fā)癥心肌肥厚，因此我們猜測miR-139-5p對(duì)AS的影響通過調(diào)控C-Jun進(jìn)行，但此猜測仍然需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果證實(shí)了miR-139-5p在AS患者血清中表達(dá)下調(diào)，且miR-139-5p表達(dá)下調(diào)是AS潛在的診斷標(biāo)志物。體外研究結(jié)果表明，過表達(dá)miR-139-5p可顯著抑制HVSMCs的增殖和遷移能力。綜上所述，miR-139-5p可能是AS臨床診斷的潛在生物標(biāo)志物，調(diào)控HVSMCs的生物學(xué)功能有望成為AS治療的潛在靶點(diǎn)。