魏長(zhǎng)浩,曹 余,鄒新華,范亞葦,李 靜,李紅艷,鄧澤元,*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.播恩生物技術(shù)股份有限公司,江西贛州 341000)

粗壯脈紋孢菌(Neurosporacrassa)是本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)從江西本土發(fā)酵豆渣食品中分離篩選得到的一株具備較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力和產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素能力的優(yōu)良真菌[1]。目前,粗壯脈紋孢菌已在多種農(nóng)副產(chǎn)品的發(fā)酵利用中取得好結(jié)果。葉俊等[2]利用粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵豆渣發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵48 h后,豆渣中的粗纖維含量得到了有效的降低,并且粗蛋白、可溶性總糖等營(yíng)養(yǎng)成分都有提高。任志青等[3]以豆粕為發(fā)酵底物,發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中纖維素得到了有效的降解,形成了糖類(lèi)物質(zhì);并且植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量也都有顯著的下降。于新穎[4]利用它來(lái)發(fā)酵菜籽粕,在利用粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕時(shí)也得到了相似的結(jié)果,并得出結(jié)論,利用粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕可以很好地改善菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)水平,提高菜籽粕的利用價(jià)值。不僅如此,Zhou等[5]還通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣中提取的低聚糖具有出色的益生作用,說(shuō)明經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵后的豆渣很有可能是極具潛力的益生食品;李靜等[1]以及杜佳等[6]通過(guò)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素進(jìn)行提取以及相關(guān)活性的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵后可以提取得到較高含量的類(lèi)胡蘿卜素,并且具有較高的抗氧化活性。此外粗壯脈紋孢菌高產(chǎn)纖維素酶以及蛋白酶的特性也是值得關(guān)注的方面,也正是因?yàn)楦呋钚缘拿赶?為粗壯脈紋孢菌更好地發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)物奠定了良好的基礎(chǔ)[7-8]。

高密度培養(yǎng)(HCDC,high cell density culture)是一種提高菌體密度的發(fā)酵方式,它沒(méi)有確切的意義,本身只是一個(gè)相對(duì)的概念[9]。高密度培養(yǎng)與常規(guī)培養(yǎng)方式相比,最顯而易見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)就是可以收獲大量的菌體,大大提高生產(chǎn)效率和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資,從而降低成本、節(jié)約資源、減少污染,提高綜合生產(chǎn)效率[10]。而合適的培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)方式是實(shí)現(xiàn)菌體高密度培養(yǎng)的重要因素。就培養(yǎng)基組成而言,在分批培養(yǎng)過(guò)程中,當(dāng)培養(yǎng)體系中的營(yíng)養(yǎng)成分(包括碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等)的濃度超過(guò)某一臨界值時(shí),微生物會(huì)為維持胞內(nèi)環(huán)境而消耗部分能量,其結(jié)果會(huì)明顯抑制菌體生長(zhǎng),降低菌體得率[11]。因此為實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng),合適的培養(yǎng)基組成不可或缺。Wang等[12]通過(guò)優(yōu)化鼠李糖桿菌最佳培養(yǎng)基組成,在最優(yōu)條件下細(xì)胞密度提高到4.5×109CFU/mL,比乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)高約9倍。就培養(yǎng)方式而言,補(bǔ)料分批培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的重要手段[13]。補(bǔ)料分批培養(yǎng)是通過(guò)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液,為微生物提供充足的養(yǎng)分,從而使細(xì)胞達(dá)到較高密度的培養(yǎng)方式,相對(duì)于其他培養(yǎng)方式,補(bǔ)料分批培養(yǎng)可以削弱底物抑制,稀釋有毒代謝物,最終達(dá)到細(xì)胞高密度培養(yǎng)。Chen等[14]發(fā)現(xiàn),通過(guò)補(bǔ)加含C、N、P和微量元素的補(bǔ)料培養(yǎng)基對(duì)紅曲霉進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng),比常規(guī)分批培養(yǎng)菌體量提高四倍。Ji等[15]也發(fā)現(xiàn),利用分批補(bǔ)料培養(yǎng)高山被孢霉能顯著縮短培養(yǎng)周期并提高代謝產(chǎn)物量。

在國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的研究中,粗壯脈紋孢菌所表現(xiàn)出的改善農(nóng)副產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的作用十分可觀,但在以往的固態(tài)培養(yǎng)方式中粗壯脈紋孢菌的菌體產(chǎn)量十分有限,限制了其在大批量工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用,因此研究粗壯脈紋孢菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)具有極大的應(yīng)用價(jià)值。本研究從優(yōu)化粗壯脈紋孢菌培養(yǎng)基組成入手,對(duì)高密度培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的組成與含量進(jìn)行了優(yōu)化,然后對(duì)比了補(bǔ)料時(shí)間、補(bǔ)料次數(shù)和補(bǔ)料碳氮比對(duì)粗壯脈紋孢菌生物量的影響,選擇一種能夠積累較高菌體生物量的補(bǔ)料培養(yǎng)策略。旨在實(shí)現(xiàn)粗壯脈紋孢菌菌體的高密度培養(yǎng),為工業(yè)生產(chǎn)中的制種提供參考,為粗壯脈紋孢菌這一優(yōu)良菌種工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗壯脈紋孢菌(NeurosporacrassaCGMCC NO.3088) 由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)篩選分離并保存;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、玉米漿(發(fā)酵型)、酵母粉(生化試劑) 上海索萊寶生物科技有限公司;蛋白胨(生化試劑) 上海盛思生化科技有限公司;所有鹽類(lèi)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HPX-160BSH恒溫恒濕箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DGG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥器 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FA1104型電子天平 上海精天電子儀器廠;HD-650桌上型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BSD-YF2200智能精密搖床 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司;PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 菌種活化:將甘油保藏的菌種接入沙氏液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、140 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)72 h,連續(xù)活化3次。

種子液的制備:將菌種接種至馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基試管斜面上,于30 ℃、濕度70%、光照條件下培養(yǎng)96 h,在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)刮取孢子并與水混合,混合液過(guò)濾除去菌絲后加水稀釋成1×106個(gè)/mL孢子懸液。

發(fā)酵培養(yǎng):配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基[14](葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸二氫鉀4 g/L,七水合硫酸鎂0.5 g/L,七水合硫酸鋅0.01 g/L,氯化鉀0.5 g/L,硫酸錳0.03 g/L),按80 mL的裝液量分裝于250 mL錐形瓶中,滅菌后接種4 mL 1×106個(gè)/mL孢子懸液。置于30 ℃、140 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)96 h。

1.2.2 菌密度測(cè)定及菌體生物量的測(cè)定 采用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算種子液中的菌體密度。

菌體生物量的測(cè)定參照Chen等[14]及劉靖[16]的方法,將發(fā)酵液過(guò)濾,并用大量蒸餾水洗滌殘留物,獲得殘留菌體,于80 ℃下烘干至恒重得到菌絲體干重(DW,dry weight)。

式中:DW表示菌絲體干重,g;V表示培養(yǎng)基的體積,mL。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的繪制 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的情況下對(duì)粗壯脈紋孢菌進(jìn)行液態(tài)搖瓶培養(yǎng),從0 h開(kāi)始至120 h結(jié)束,每間隔6 h 取樣測(cè)定菌體生物量并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 不同碳源對(duì)粗壯脈紋孢菌高密度培養(yǎng)的影響 在保證氮源和無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度不變的情況下,使用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為不同的碳源替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)96 h,并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物量的測(cè)定、比較分析,確定最佳碳源。

1.2.4.2 不同氮源種類(lèi)對(duì)粗壯脈紋孢菌高密度培養(yǎng)的影響 在最佳碳源條件下,保證無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度不變,使用硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿、硝酸鈉作為不同的氮源替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源,在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)96 h,并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物量的測(cè)定、比較分析,確定最佳氮源。

1.2.4.3 不同蔗糖含量對(duì)粗壯脈紋孢菌高密度培養(yǎng)的影響 在最佳碳源和最佳氮源條件下,保證無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)、氮源濃度及無(wú)機(jī)鹽濃度不變,使用10、20、40、60、80、100 g/L作為不同蔗糖濃度替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖含量并保持其余營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度不變,在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)96 h,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物量的測(cè)定、比較分析,確定最佳蔗糖含量。

1.2.4.4 不同蛋白胨的含量對(duì)粗壯脈紋孢菌高密度培養(yǎng)的影響 在最佳碳源、最佳氮源以及最佳碳源濃度的條件下,保證無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及濃度不變,使用10、20、30、40、50、60 g/L作為不同蛋白胨濃度替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨含量,在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)96 h,并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物量的測(cè)定、比較分析,確定最佳蛋白胨的含量。

1.2.4.5 不同無(wú)機(jī)鹽含量對(duì)粗壯脈紋孢菌高密度培養(yǎng)的影響 在最佳碳氮源以及最佳碳氮源濃度條件下,除考察因素外其余無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及濃度不變,以KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、KCl、MnSO4·H2O為考察因素分別設(shè)定濃度梯度KH2PO4(1、3、5、7、9、11 g/L)、MgSO4·7H2O(0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L)、ZnSO4·7H2O(0、0.01、0.06、0.11、0.16、0.21、0.26 g/L)、KCl(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L)、MnSO4·H2O(0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 g/L),考察不同無(wú)機(jī)鹽及其濃度對(duì)菌體生物量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 利用Box-Benhnken(BB)實(shí)驗(yàn)方法[17],選擇碳源含量、氮源含量、磷酸鹽含量以及硫酸鋅含量為關(guān)鍵因素,采用4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面分析,應(yīng)用 Design-Expert 11軟件設(shè)計(jì)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果(每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次),得到最適合粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方。

1.2.6 粗壯脈紋孢菌高密度培養(yǎng)補(bǔ)料策略的確定

1.2.6.1 補(bǔ)料時(shí)間的確定 通過(guò)粗壯脈紋孢菌搖瓶分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線確定補(bǔ)料時(shí)間。以最適培養(yǎng)基對(duì)粗壯脈紋孢菌進(jìn)行培養(yǎng),從0 h開(kāi)始至120 h結(jié)束,每間隔12 h 取樣測(cè)定菌體生物量及殘?zhí)呛?并繪制動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.6.2 補(bǔ)糖濃度的確定 選取40、80、120、160、200、400 g/L的蔗糖溶液作為不同糖濃度的補(bǔ)料液,在補(bǔ)料時(shí)間24～96 h內(nèi),每隔12 h向揺瓶中補(bǔ)加10 mL不同糖濃度的補(bǔ)料液,培養(yǎng)至108 h,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物量的測(cè)定,并設(shè)置對(duì)照組,觀察不同補(bǔ)糖濃度對(duì)粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)的影響,確定最佳補(bǔ)糖濃度。

1.2.6.3 補(bǔ)料次數(shù)的確定 選取補(bǔ)料1次(24 h補(bǔ)料一次)、補(bǔ)料3次(每隔36 h補(bǔ)料一次)、補(bǔ)料4次(每隔24 h補(bǔ)料一次)、補(bǔ)料7次(每隔12 h補(bǔ)料一次)作為不同補(bǔ)料次數(shù),在補(bǔ)料時(shí)間24～96 h內(nèi),每次向揺瓶中補(bǔ)加200 g/L的蔗糖溶液10 mL,培養(yǎng)至108 h,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物量的測(cè)定,并設(shè)置對(duì)照組,觀察不同補(bǔ)料次數(shù)對(duì)粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)的影響,確定最佳補(bǔ)料次數(shù)。

1.2.6.4 補(bǔ)料碳氮比的確定 在補(bǔ)料液中保持碳源濃度不變,選取1∶0、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1作為不同補(bǔ)料碳氮源濃度比,分別在培養(yǎng)24、60、96 h時(shí)向揺瓶中補(bǔ)加10 mL不同碳氮濃度比的補(bǔ)料液,培養(yǎng)至108 h,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物量的測(cè)定,并設(shè)置對(duì)照組,觀察不同補(bǔ)料碳氮濃度比對(duì)粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)的影響,確定最佳補(bǔ)料碳氮濃度比。

1.2.7 糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定發(fā)酵液中糖的含量[18]。取1 mL樣液加入1 mL 6%的苯酚及5 mL的濃硫酸,搖勻,靜置反應(yīng)20 min后于490 nm測(cè)定其吸光值。使用不同濃度的葡萄糖溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,蒸餾水為空白對(duì)照,對(duì)發(fā)酵液樣品中糖含量進(jìn)行定量。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=5.6743x+0.086(R2=0.9968)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert 11進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)和分析,用Origin 2017軟件制圖并對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線進(jìn)行Logistics方程擬合以及生長(zhǎng)速率的計(jì)算,用SPSS 19軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05),結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體生長(zhǎng)曲線

粗壯脈紋孢菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。圖1表明粗壯脈紋孢菌的生長(zhǎng)規(guī)律符合微生物生長(zhǎng)一般規(guī)律。從 0～6 h,菌體濃度上升緩慢,菌體處于遲緩期,從第6 h開(kāi)始,菌體生物量迅速上升,從 0.125 g/L驟增至96 h的6.088 g/L,該時(shí)間段包括了菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體細(xì)胞高速生長(zhǎng)繁殖;從96 h 開(kāi)始,菌體生長(zhǎng)趨于平穩(wěn),至120 h實(shí)驗(yàn)結(jié)束,該階段菌種處于穩(wěn)定期,即新繁殖的菌體與衰亡的菌體數(shù)相等,或正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)相等的動(dòng)態(tài)平衡中。造成該現(xiàn)象的原因是由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,毒性代謝產(chǎn)物積聚,pH下降,使菌體的繁殖速度漸趨減慢[19]。因此確定菌體生長(zhǎng)時(shí)間為0～96 h。

圖1 粗壯脈紋孢菌培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1 碳源的選擇 由圖2可知,不同種類(lèi)的碳源對(duì)粗壯脈紋孢菌生物量的影響差異明顯,其中利用蔗糖作為碳源能獲得最大的生物量7.238 g/L,而淀粉、麥芽糖和葡萄糖的生物量分別只有6.256、5.963、5.088 g/L,均低于蔗糖的生物量。當(dāng)使用乳糖作為碳源時(shí),菌體生物量為最低值1.219 g/L,說(shuō)明乳糖最不適合作為粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)的碳源。綜上所述,選擇蔗糖作為培養(yǎng)基碳源進(jìn)行下一步優(yōu)化。

圖2 不同碳源對(duì)粗壯脈紋孢菌生物量的影響

2.2.2 氮源的選擇 由圖3可知,蛋白胨相對(duì)于其他四種氮源來(lái)說(shuō),能收獲最大的菌體量7.450 g/L,其次是酵母粉6.944 g/L和玉米漿5.150 g/L,因此選擇蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源進(jìn)行下一步優(yōu)化。從圖中還可以看出,以有機(jī)氮源的玉米漿、酵母粉以及蛋白胨為培養(yǎng)基唯一氮源時(shí),所獲得的菌體量要遠(yuǎn)大于無(wú)機(jī)氮源硫酸銨和硝酸鈉作為培養(yǎng)基氮源。魏培蓮等[20]在進(jìn)行發(fā)酵紅曲霉培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)相對(duì)于無(wú)機(jī)氮源硝酸銨,蛋白胨、酵母粉和牛肉膏等有機(jī)氮源作為唯一氮源時(shí)能得到更大的生物量。結(jié)果表明,粗壯脈紋孢菌在有機(jī)氮源作為唯一氮源的情況下能獲得更好的生長(zhǎng)。

圖3 不同氮源對(duì)粗壯脈紋孢菌生物量的影響

2.2.3 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽添加水平的選擇

2.2.3.1 蔗糖添加量的選擇 從圖4中可以看出,隨著蔗糖添加量的提升,菌體生物量呈現(xiàn)一個(gè)先增后減的趨勢(shì),在蔗糖濃度為40 g/L時(shí),菌體生物量達(dá)到最高8.856 g/L。說(shuō)明過(guò)低的蔗糖含量可能導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足,菌體的生長(zhǎng)受到限制,反之過(guò)高的糖含量其本身就會(huì)直接限制菌體的生長(zhǎng)[11]。因此蔗糖添加量選擇40 g/L時(shí)用來(lái)發(fā)酵培養(yǎng)效果最佳。

圖4 不同蔗糖濃度對(duì)生物量的影響

2.2.3.2 蛋白胨添加量的選擇 從圖5中可以看出,隨著蛋白胨添加量的增加,生物量呈現(xiàn)與不同蔗糖濃度生物量相近的變化趨勢(shì),當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿窟x擇40 g/L時(shí)，可以獲得最大的生物量10.506 g/L,用來(lái)發(fā)酵培養(yǎng)效果最佳。

圖5 不同蛋白胨濃度對(duì)生物量的影響

2.2.3.3 無(wú)機(jī)鹽添加量選擇 由圖6(a)和圖6(c)可知,五種無(wú)機(jī)鹽中,磷酸二氫鉀和硫酸鋅隨著濃度變化對(duì)生物量有著明顯的影響,磷酸二氫鉀濃度為3 g/L時(shí)生物量達(dá)到最大,硫酸鋅為0.01 g/L時(shí)生物量達(dá)到最大。硫酸錳和氯化鉀在一定的濃度內(nèi),對(duì)生物量的影響基本保持一個(gè)范圍內(nèi)波動(dòng)。硫酸鎂則隨著濃度的增加,生物量呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì),無(wú)法確定峰值,說(shuō)明適量就可。因此確定硫酸鎂、硫酸錳、氯化鉀的添加量分別為0.1、0.03、0.1 g/L,并選擇磷酸二氫鉀和硫酸鋅兩種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

圖6 不同種類(lèi)無(wú)機(jī)鹽及濃度對(duì)粗壯脈紋胞菌生物量的影響

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 通過(guò)上述單因素實(shí)驗(yàn),確定了蔗糖添加量、蛋白胨添加量、磷酸二氫鉀添加量以及硫酸鋅添加量作為實(shí)驗(yàn)因素,其他培養(yǎng)基成分按硫酸鎂0.1 g/L、硫酸錳0.03 g/L、氯化鉀0.1 g/L添加。利用Design Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),詳見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次方模型方差分析

由表3可知,該實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的模型P<0.0001,極為顯著;且擬合模型的失擬項(xiàng)P值為0.0698>0.05,不顯著;結(jié)果表明模型在整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)的擬合度高,與實(shí)際情況相似。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,得到模型擬合方程為:生物量(g/L)=11.3425+0.178125A+0.0427083B-0.071875C+0.669792D-1.08125AB+0.24375AC+0.803125AD+0.346875BC-0.75625BD+0.08125CD-0.998854A2-0.458229B2-0.448854C2-1.55198D2。模型的確定系數(shù)R2=0.9516,校正后的系數(shù)R2=0.9033,也說(shuō)明模型擬合程度良好。而且從各項(xiàng)的方差分析中可以看出,各因素對(duì)生物量的影響從大到小排序?yàn)?D>A>C>B,表中D,AB,AD,BD,A2,D2,B2,C2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(P<0.01)。

表4 不同補(bǔ)糖濃度對(duì)粗壯脈紋孢菌生物量的影響

表5 不同補(bǔ)料次數(shù)對(duì)粗壯脈紋孢菌生物量的影響

由圖7可知，AB、AD、BD交互作用的等高線呈橢圓形，說(shuō)明其對(duì)響應(yīng)值影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。根據(jù)響應(yīng)曲面模型計(jì)算,當(dāng)蔗糖濃度為42.356 g/L、蛋白胨濃度為35.938 g/L、磷酸二氫鉀濃度為2.614 g/L、硫酸鋅濃度為0.038 g/L時(shí),可以得到最大的菌體生物量11.483 g/L。使用響應(yīng)曲面模型得到的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)際條件為：蔗糖42 g/L，蛋白胨36 g/L，磷酸二氫鉀2.6 g/L,硫酸鋅0.038 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，硫酸錳0.03 g/L，氯化鉀0.1 g/L,得到的菌體生物量為11.295 g/L,與模型預(yù)測(cè)值接近,由此可知,基于響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的粗壯脈紋孢菌最佳培養(yǎng)基組成數(shù)據(jù)可靠,具有實(shí)際利用價(jià)值。

圖7 各因素交互作用響應(yīng)曲面及等高線圖

2.2.5 粗壯脈紋孢菌分批補(bǔ)料策略的確定

2.2.5.1 粗壯脈紋孢菌補(bǔ)料時(shí)間的確定 由圖8、圖9可以看出,菌體生長(zhǎng)在12 h之前都處于一個(gè)十分緩慢的階段,培養(yǎng)基的糖含量并沒(méi)有大幅度的下降;12 h以后,菌體生長(zhǎng)速度加快,糖消耗量也逐漸增多,表明菌體生長(zhǎng)進(jìn)入了指數(shù)期;培養(yǎng)至96 h時(shí)菌體生物量達(dá)到了最大值11.295 g/L,之后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,同時(shí)作為碳源的糖類(lèi)物質(zhì)含量下降到極少。結(jié)合糖消耗曲線以及菌體生長(zhǎng)速率曲線來(lái)看,12～36 h的糖消耗速率極快,生長(zhǎng)速率也極快的增加,說(shuō)明這一段時(shí)間菌體在高速生長(zhǎng)。36 h后生長(zhǎng)速率開(kāi)始下降,說(shuō)明糖含量的降低已經(jīng)對(duì)菌體的生長(zhǎng)造成了影響[21]。因此,綜合考慮確定補(bǔ)料的時(shí)間為24～96 h,每12 h進(jìn)行一次補(bǔ)料,培養(yǎng)至108 h停止。

2.2.5.2 粗壯脈紋孢菌分批補(bǔ)料碳源濃度的確定 由表4可知,通過(guò)搖瓶分批補(bǔ)料的方式確定最適補(bǔ)糖濃度為200 g/L,培養(yǎng)108 h后可收獲8.351±0.228 g/L菌絲體,且發(fā)現(xiàn)過(guò)高和過(guò)低的補(bǔ)糖濃度均會(huì)限制粗壯脈紋孢菌的生長(zhǎng)。與不添加補(bǔ)料培養(yǎng)基的對(duì)照組比較生物量明顯降低,原因是補(bǔ)加的培養(yǎng)基會(huì)稀釋原培養(yǎng)基中的菌體密度并且導(dǎo)致培養(yǎng)基中各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生變化。王有旭[22]在黑曲霉的補(bǔ)料分批培養(yǎng)產(chǎn)檸檬酸的研究中發(fā)現(xiàn),隨著補(bǔ)料次數(shù)的增加導(dǎo)致補(bǔ)料量過(guò)大,發(fā)酵指數(shù)和轉(zhuǎn)化率都呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì),殘?zhí)呛恳矔?huì)隨之上升。因此考慮通過(guò)改變補(bǔ)料次數(shù),來(lái)減弱補(bǔ)料這一方式對(duì)菌體帶來(lái)的不利影響,從而獲得更多的生物量以達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的。

表6 不同補(bǔ)料碳氮比對(duì)粗壯脈紋孢菌生物量的影響

圖8 最適培養(yǎng)基下的粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)曲線及不同發(fā)酵時(shí)間的殘?zhí)呛?/p>

圖9 粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)速率曲線

2.2.5.3 粗壯脈紋孢菌分批補(bǔ)料次數(shù)的確定 由表 5 可知,在0～108 h的補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),當(dāng)補(bǔ)料次數(shù)為3次時(shí),可獲得最大生物量15.092±0.283 g/L。過(guò)少補(bǔ)料次數(shù)的實(shí)驗(yàn)組雖然與未進(jìn)行補(bǔ)料的對(duì)照組相比生物量有所增加,但生物量還是低于補(bǔ)料三次的實(shí)驗(yàn)組,原因可能是菌體生長(zhǎng)過(guò)程中因?yàn)檠a(bǔ)料過(guò)少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足從而影響菌體的生長(zhǎng),反之過(guò)多的補(bǔ)料次數(shù)的實(shí)驗(yàn)組則會(huì)因?yàn)榧尤肓诉^(guò)多的培養(yǎng)基,從而改變菌體密度,降低溶氧量,導(dǎo)致菌體生物量降低。因此,選擇補(bǔ)料3次為最佳補(bǔ)料次數(shù)。

2.2.5.4 粗壯脈紋孢菌分批補(bǔ)料碳氮比的確定 碳氮比是補(bǔ)料培養(yǎng)基中不可忽視的一項(xiàng)重要因素,碳氮比過(guò)高和過(guò)低都不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)和積累,過(guò)低導(dǎo)致菌體提早自溶;過(guò)高導(dǎo)致細(xì)菌代謝不平衡,最終不利于產(chǎn)物的積累,嚴(yán)重影響菌體的生長(zhǎng)和代謝[16,23]。在搖瓶培養(yǎng)中,以蔗糖作為微生物培養(yǎng)基碳源,蛋白胨作為氮源,保證碳源濃度和補(bǔ)料添加量不變的情況下對(duì)粗壯脈紋孢菌進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)。由表6可知,相對(duì)于不添加任何物質(zhì)的對(duì)照組相比,只添加碳源能得到最大的菌體生物量,并且隨著氮源添加量的下降,菌體反而呈現(xiàn)一個(gè)生長(zhǎng)更加旺盛的趨勢(shì)。說(shuō)明在粗壯脈紋孢菌的初始培養(yǎng)基中氮源充足且不會(huì)成為菌體生長(zhǎng)的限制性因素,因此不需要補(bǔ)加氮源。

3 結(jié)論

本研究以粗壯脈紋孢菌作為研究菌種,對(duì)其高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成以及分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,合適的粗壯脈紋孢菌培養(yǎng)基組成以及間歇補(bǔ)料方式能有效地促進(jìn)粗壯脈紋孢菌的生長(zhǎng)。在最佳培養(yǎng)基組成:蔗糖42 g/L、蛋白胨36 g/L、磷酸二氫鉀2.6 g/L、硫酸鋅0.038 g/L、硫酸鎂0.1 g/L、硫酸錳0.03 g/L、氯化鉀0.1 g/L的基礎(chǔ)上分別于培養(yǎng)24、60、96 h進(jìn)行補(bǔ)料,共補(bǔ)料3次,每次補(bǔ)加200 g/L的蔗糖溶液10 mL,可獲得粗壯脈紋孢菌的最大生物量14.732 g/L,是未優(yōu)化之前粗壯脈紋孢菌生物量的2.42倍。結(jié)果表明通過(guò)發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)粗壯脈紋孢菌的高密度培養(yǎng)是切實(shí)可行的,也為之后大批量工業(yè)化制種提供了一定的理論支持。對(duì)于其他補(bǔ)料方式,如恒pH補(bǔ)料以及葡萄糖反饋補(bǔ)料等對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響以及發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步的探索和優(yōu)化。