包橋橋,李夢茹,黃 榕,陳金嬌,劉洪章,劉樹英

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130118)

胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要特征之一,是導(dǎo)致高血壓、冠心病的重要原因[1]。其癥狀主要表現(xiàn)為由胰島素調(diào)控的促進(jìn)脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞的糖代謝能力下降,機體代償性地分泌過高濃度胰島素來維持機體血液中葡萄糖含量穩(wěn)態(tài)的現(xiàn)象[1-2]。作為胰島素信號通路的重要組成部分,AKT-FOXO1信號通路對胰島素抵抗起關(guān)鍵性作用[3]。通過調(diào)節(jié)AKT的磷酸化和FOXO1的核轉(zhuǎn)移促進(jìn)肝糖原合成,抑制肝糖原分解,從而改善胰島素抵抗[4-5]。

異鼠李素是沙棘黃酮中的主要活性成分之一,也存在于多種植物當(dāng)中[6-9]。已有研究表明,異鼠李素能夠改善糖尿病及其并發(fā)癥,具有降血糖[10-11]、調(diào)血脂[12]、改善胰島素抵抗[13],是一種潛在的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物。但在對于異鼠李素在改善胰島素抵抗作用機制方面的研究尚存在不足。Jiang等[14]通過研究證明異鼠李素可調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路,然而目前能否通過AKT-FOXO1信號通路改善胰島素抵抗并未證實。

本研究通過異鼠李素作用于高濃度胰島素誘導(dǎo)制備人肝癌HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型[15-16],檢測細(xì)胞糖代謝水平變化,且從蛋白表達(dá)水平衡量異鼠李素調(diào)控AKT-FOXO1信號通路的作用效果,揭示異鼠李素改善胰島素抵抗機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異鼠李素(98%) 上海源葉生物科技有限公司;Hepg2細(xì)胞 中國科學(xué)院細(xì)胞庫;PBS緩沖液、DMEM培養(yǎng)基 ?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司;DMEM無酚紅培養(yǎng)基 吉林省吉諾生物工程有限公司;牛血清白蛋白、胰島素、胰蛋白酶-EDTA溶液、MTT(噻唑藍(lán))、二甲基亞砜、青霉素-鏈霉素混合液 北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖測試盒 南京建成生物工程研究所;蛋白預(yù)制膠、BCA蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒、二甲雙胍、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板、6孔板 康寧生命科學(xué)有限公司;抗體 p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)、AKT、FOXO1、G6pase、PEPCK、β-actin 北京博奧森生物技術(shù)有限公司;彩虹Marker、10×TBS封閉洗滌緩沖溶液 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Tween-20、SDS電泳上樣緩沖液 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Western轉(zhuǎn)膜緩沖液 白鯊生物科技有限公司。

BPN-40RHP二氧化碳培養(yǎng)箱 上海一恒;D1Mi倒置顯微鏡 德國徠卡公司;CGF-300臺式高速低溫冷凍離心機 北宏科技;1703940半干轉(zhuǎn)膜儀 美國伯樂;WD-9423B化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、DYCZ-24DN垂直電泳槽 北京六一;EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海天能;BIOBASE-EL10A酶標(biāo)儀 上海博科;752N紫外分光光度計 上海精科。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hepg2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含100 mL/L胎牛血清,100 U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至95%傳代繼續(xù)培養(yǎng)[17]。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(MTT)法試驗 將對數(shù)生長期的細(xì)胞,于96孔板中以1×105個/孔鋪板,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層長滿孔底,血清剝奪12 h后,設(shè)置空白對照組及藥物處理組(處理濃度分別為:60、30、15、7.5、3.8、2、1、0.5 μg/mL),處理濃度每組設(shè)置6個復(fù)孔。將1 mg異鼠李素溶于10 μL 75%乙醇中,培養(yǎng)基稀釋至終濃度為60 μg/mL,以二倍稀釋法給藥處理,設(shè)置最低濃度為0.5 μg/mL。12 h后每孔加入20 μL濃度為0.5%的MTT溶液孵育4 h,棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基,PBS清洗后每孔加入100 μL二甲基亞砜,搖床振蕩10 min,設(shè)置轉(zhuǎn)速為40 r/min,490 nm處測每孔吸光度值并計算細(xì)胞存活率[17],公式如下:

將未添加異鼠李素處理的組別設(shè)為正常組,設(shè)定細(xì)胞存活率為“100%”,繪圖并分析結(jié)果。

1.2.3 胰島素抵抗(IR)模型建立 將對數(shù)生長期的細(xì)胞,以懸液密度為2×105個/mL接種于六孔板中,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后血清剝奪12 h,以胰島素濃度為1×10-6mol/L藥用培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)處理36 h即為胰島素抵抗模型。

1.2.4 葡萄糖代謝水平測試 將已建立好的胰島素抵抗模型,以10 μmol/L二甲雙胍為陽性對照,使用無酚紅培養(yǎng)基配制不同劑量分組給藥;根據(jù)MTT試驗結(jié)果,共設(shè)置六組別,分別為:空白組(C)、模型組(B)、陽性對照(Met,1 mmol/L二甲雙胍)、低劑量組(1 μg/mL)、中劑量組(2 μg/mL)、高劑量組(3.8 μg/mL),處理12 h后取培養(yǎng)基離心取上清,參照葡萄糖檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞葡萄糖消耗量。

1.2.5 Western Blot檢測AKT-FOXO1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 使用Western Blot方法檢測AKT、FOXO1、p-AKT、p-FOXO1、G6pcse、PEPCK、β-actin共七種蛋白的表達(dá)情況。將胰島素抵抗模型建立完成后的細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗三遍后,分別加入含有不同濃度(低劑量組:1 μg/mL;中劑量組:2 μg/mL;高劑量組:3.8 μg/mL)的異鼠李素的藥用培養(yǎng)基,處理12 h。藥物處理后細(xì)胞棄去上清,分別以預(yù)冷的PBS清洗三次,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測蛋白濃度備用。變性后取20 μg上樣,10% SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入抗體,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后,以相應(yīng)二抗常溫孵育。ECL 法顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶濃度[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行組間單因素方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT試驗檢測異鼠李素對HepG2細(xì)胞生長影響

設(shè)置最高濃度為60 μg/mL,最低濃度為0.5 μg/mL,以2倍稀釋法分組給藥,以無血清培養(yǎng)基作為對照組,結(jié)果如圖1所示。與正常組比較,當(dāng)異鼠李素濃度在大于7.5 μg/mL 時,細(xì)胞存活率為小于80.7%，顯著抑制HepG2細(xì)胞生長(P<0.05),當(dāng)濃度在3.8～1 μg/mL時對HepG2細(xì)胞生長無危害,細(xì)胞存活率在0.943與1.093之間,當(dāng)異鼠李素濃度為1 μg/mL時,可有效促進(jìn)細(xì)胞生長;當(dāng)濃度繼續(xù)減小時,HepG2細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。當(dāng)異鼠李素濃度減小至0.5 μg/mL時,細(xì)胞存活率為:79%。因此選定異鼠李素濃度在3.8～1 μg/mL時為安全用藥劑量。故選取3.8、2、1 μg/mL分別為高、中、低劑量組。

圖1 異鼠李素對Hepg2細(xì)胞活力的影響

2.2 異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

如圖2所示,表明空白組葡萄糖消耗量為4.473 mg/mL,與之比較模型組葡萄糖消耗量明顯減少,其數(shù)值為1.7 mg/mL,存在極顯著性差異(P<0.001),因此胰島素模型造模成功;與模型組比較,陽性對照組及試驗組葡萄糖消耗量均顯著增加(P<0.05),陽性對照組葡萄糖消耗量為4 mg/mL。試驗組的細(xì)胞葡萄糖消耗量隨劑量升高而降低,其中高劑量組葡萄糖消耗量為2.6 mg/mL;低劑量組葡萄糖消耗量達(dá)4.3 mg/mL,與空白組和陽性對照組葡萄糖消耗量相當(dāng)。

圖2 異鼠李素對 IR HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗影響

2.3 異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞Akt和FOXO1蛋白磷酸化影響

如圖3A、3B所示,各劑量組AKT蛋白的表達(dá)水平與FOXO1蛋白表達(dá)水平趨于一致,表明實驗結(jié)果具有可靠性,并且該組試驗分別以AKT蛋白表達(dá)和FOXO1蛋白表達(dá)作為內(nèi)參。如圖3C、3D所示,分別將AKT蛋白與FOXO1蛋白作為內(nèi)參蛋白,衡量兩蛋白磷酸化水平變化,即p-AKT蛋白與p-FOXO1蛋白相對于AKT蛋白與FOXO1蛋白表達(dá)量的變化:與空白組比較,模型組p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)蛋白表達(dá)明顯降低且存在極顯著性差異(P<0.001),因此胰島素抵抗模型造模成功;相較于模型組,實驗組p-AKT(Ser473)和p-FOXO1(Ser256)蛋白表達(dá)均明顯增加,且隨劑量升高而下降。p-AKT的蛋白表達(dá),低劑量組與模型組存在極顯著性差異(P<0.001)高劑量組的蛋白水平與模型組并無顯著性差異(P>0.05);P-FOXO1三個劑量組均與模型組皆有顯著差異(P<0.05),且低劑量組p-FOXO1的蛋白表達(dá)量與陽性對照組相當(dāng)。

圖3 異鼠李素對IR Hepg2細(xì)胞AKT和FOXO1蛋白磷酸化水平影響

2.4 異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞G6pase和PEPCK蛋白表達(dá)水平影響

如圖4A所示,選取β-actin作為內(nèi)參蛋白,且在該組試驗中,內(nèi)參表達(dá)水平趨于一致,說明試驗具有可靠性。故以PEPCK蛋白和G6pase蛋白相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量作為衡量蛋白表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn),如圖4B和4C所示。如圖所示,與空白組比較,模型組PEPCK、G6pase、蛋白表達(dá)明顯升高且存在極顯著性差異(P<0.001)。G6pase與PEPCK的蛋白表達(dá)量均隨劑量升高而升高,陽性對照與低劑量組較模型組相比均具有顯著差異(P<0.01)且G6pase低劑量組蛋白表達(dá)量與陽性對照組相當(dāng)。

圖4 異鼠李素對IR Hepg2細(xì)胞G6pcse和PEPCK蛋白表達(dá)的影響

3 結(jié)論

胰島素抵抗是指由各種原因,如高血壓、肥胖等引起的胰島素敏感性下降,是治療Ⅱ型糖尿病的關(guān)鍵途徑之一。肝臟在糖代謝過程中發(fā)揮著重要作用,胰島素通過下調(diào)肝臟肝糖原合成與分解、糖異生等過程調(diào)節(jié)機體的糖代謝過程,因此胰島素抵抗嚴(yán)重影響肝糖代謝[19]。

科研人員在對胰島素抵抗治療研究當(dāng)中,將大量目光集中于天然產(chǎn)物的應(yīng)用上,其中黃酮類化合物在胰島素抵抗治療方面具有顯著療效。異鼠李素是廣泛存在于自然界中的一種黃酮類化合物,具有調(diào)節(jié)糖代謝,治療糖尿病等作用[20]。

AKT/FOXO1信號通路處于胰島素信號通路下游,是調(diào)節(jié)糖原合成并維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要途徑。FOXO1蛋白是細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子,主要調(diào)控G6pase和PEPCK蛋白的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)細(xì)胞的糖原分解。通過AKT蛋白在Ser473位點磷酸化,激活A(yù)KT蛋白。磷酸化的AKT蛋白促進(jìn)FOXO1蛋白磷酸化并向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移,抑制G6pase和PEPCK蛋白的轉(zhuǎn)錄,從而抑制糖原分解。當(dāng)細(xì)胞受高濃度胰島素作用產(chǎn)生胰島素抵抗后,細(xì)胞糖代謝紊亂,糖原合成機能受損。因此,通過激活A(yù)KT/FOXO1信號通路可改善細(xì)胞胰島素抵抗現(xiàn)象,維持細(xì)胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

本試驗通過將異鼠李素作用于高濃度胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗的Hepg2細(xì)胞模型[21-23],以二甲雙胍為陽性對照,評估異鼠李素改善Hepg2細(xì)胞胰島素抵抗作用,并通過檢測AKT/FOXO1信號通路相關(guān)指標(biāo),研究其作用機制[24-25]。由試驗結(jié)果表明,異鼠李素具有改善胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗量的作用。且給予異鼠李素刺激后,胰島素抵抗細(xì)胞的p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)蛋白表達(dá)顯著增加,PEPCK、G6pase的蛋白表達(dá)量顯著減小,明顯改善細(xì)胞胰島素抵抗,推測其可能是通過促進(jìn)ATK蛋白磷酸化從而增加FOXO1蛋白磷酸化,減少PEPCK和G6pase的蛋白表達(dá)水平以發(fā)揮降低血糖,改善胰島素抵抗作用從而緩解2型糖尿病癥狀。Jiang等[14]通過試驗研究證明,異鼠李素可通過激活I(lǐng)RS/PI3K/AKT信號通路促進(jìn)L6肌管的葡萄糖攝取,維持細(xì)胞糖代謝穩(wěn)態(tài);Jia等[15]發(fā)現(xiàn)異鼠李素可調(diào)節(jié)胰島素敏感性抑制胰高血糖作用,與本研究成果相符。值得關(guān)注的是,本試驗結(jié)果中在安全用藥范圍內(nèi),雖然各劑量組皆可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝,但異鼠李素的藥理活性呈劑量依賴性降低,即低劑量組葡萄糖代謝水平及蛋白水平優(yōu)于高劑量組。對照MTT試驗結(jié)果,根據(jù)藥物的量效關(guān)系可得[26]：因異鼠李素藥理活性強,微量差異即可對細(xì)胞活力產(chǎn)生較大影響。在選用的三組劑量中,給藥劑量為1 μg/mL時細(xì)胞活力最強,其葡萄糖代謝水平與二甲雙胍相當(dāng),而高劑量組雖對細(xì)胞沒有顯著性傷害,但細(xì)胞活力卻較低,影響了細(xì)胞的代謝水平,因此低劑量組細(xì)胞的葡萄糖代謝水平高于高劑量組葡萄糖代謝水平。

綜上所述,異鼠李素可通過調(diào)節(jié)AKT/FOXO1信號通路改善高濃度胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗。