禹海鑫　馬福歡　孫民琴　李琨淵　郭驍駒

摘要：介殼蟲(chóng)尤其是檢疫性害蟲(chóng)——松突圓蚧及相近種類(lèi)嚴(yán)重危害我國(guó)的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)，為豐富蚧蟲(chóng)的基因條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，探索松突圓蚧及相近種類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以利于用28S rRNA基因作DNA條形碼快速準(zhǔn)確地鑒定這些蚧蟲(chóng)種類(lèi)。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增10種松突圓蚧及相近種類(lèi)的28S rRNA序列并進(jìn)行序列比對(duì)，以分析其序列組成變異及堿基替換規(guī)律，最后利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，28S rRNA作為DNA條形碼能夠很好地區(qū)分鑒定10種蚧蟲(chóng)。

關(guān)鍵詞：松突圓蚧;28S rRNA;DNA條形碼;系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類(lèi)號(hào)： S433.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0111-04

收稿日期：2019-11-29

基金項(xiàng)目：南京海關(guān)科技計(jì)劃（編號(hào)：2018KJ58）。

作者簡(jiǎn)介：禹海鑫（1984—），男，河南泌陽(yáng)人，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫、昆蟲(chóng)分類(lèi)和昆蟲(chóng)分子化學(xué)生態(tài)學(xué)研究。Tel：（0513）68588180，E-mail：haixin.007@163.com。

盾蚧科（Diaspididae）屬于昆蟲(chóng)綱（Insecta）半翅目（Hemiptera）蚧總科（Coccoidea），是蚧總科中種類(lèi)較豐富的類(lèi)群之一，該科蚧蟲(chóng)往往分布廣、危害大、防控難，且個(gè)體微小，易于藏匿，主要以成蟲(chóng)和若蟲(chóng)取食寄主植物的幼嫩部位，刺吸植物地上部分的葉片、莖及樹(shù)皮等部位汁液進(jìn)行危害，少部分刺吸植物地下部分的根及塊根，使植物的生長(zhǎng)勢(shì)頭變?nèi)?。它們還可以通過(guò)攜帶病原微生物進(jìn)行傳播，導(dǎo)致植物病害大面積發(fā)生;另外，蟲(chóng)體排出的蜜露常誘致煤污病的產(chǎn)生，從而影響生物光合作用，對(duì)松林資源、自然景觀等生態(tài)影響巨大，不少盾蚧科種類(lèi)是重要的農(nóng)業(yè)及林業(yè)害蟲(chóng)[1]。其中，松突圓蚧（Hemiberlesia pitysophila）由于對(duì)我國(guó)松林能夠產(chǎn)生嚴(yán)重危害，被2007 年發(fā)布的《進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》列為我國(guó)檢疫性昆蟲(chóng)[2]。

近年來(lái)，隨著我國(guó)外向型經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，種苗花卉等貨物的進(jìn)出口量劇增，國(guó)內(nèi)多個(gè)口岸在進(jìn)境種苗花卉、船舶、集裝箱檢疫工作中也多次截獲到檢疫性松突圓蚧及其近似種類(lèi)[3]，但該類(lèi)蚧蟲(chóng)常常會(huì)以卵、若蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、身體破損等的形式出現(xiàn)，快速準(zhǔn)確鑒定相當(dāng)困難。因此，需要探索新方法來(lái)解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定中遇到的困境。隨著分子試驗(yàn)技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用DNA條形碼研究種類(lèi)鑒定、系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)成為昆蟲(chóng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。常用的DNA條形碼包括線粒體DNA（mitochondrial DNA，簡(jiǎn)稱mtDNA）[4]、ITS2[5]、28S[6] 和18S[7]，均已被廣泛應(yīng)用于蚧蟲(chóng)的分子鑒定研究中。王玉生利用雙基因條形碼鑒定技術(shù)研究我國(guó)常見(jiàn)粉蚧類(lèi)害蟲(chóng)的種類(lèi)分布[8]。石晶晶基于分子標(biāo)記COⅠ、28S、18S實(shí)現(xiàn)了對(duì)新菠蘿灰粉蚧與菠蘿粉蚧種類(lèi)的多基因條形碼分子鑒定識(shí)別[9]。此外，Geoffrey等對(duì)盾蚧科2個(gè)亞科 5個(gè)族47個(gè)屬89個(gè)種的91個(gè)標(biāo)本基于核基因 EF-lα 和 28S rRNA 進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，該研究是第1次針對(duì)盾蚧科類(lèi)群采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析，但該研究只收集了盾蚧科中2個(gè)主要亞科的標(biāo)本，不能全面地表現(xiàn)該科中各類(lèi)群之間的相互關(guān)系，其中采集于我國(guó)的標(biāo)本只有1頭[10]。何衍彪等通過(guò)對(duì)柑橘臀紋粉蚧、大洋臀紋粉蚧、無(wú)花果臀紋粉蚧3種近緣種粉蚧的COⅠ序列以及 18S rRNA 和 28S rRNA 基因序列的比對(duì)分析后，認(rèn)為 COⅠ序列的變異程度更高，可以作為這3種近緣種粉蚧鑒別的依據(jù)[11]。

本研究對(duì)已獲得的10種松突圓蚧及其近似種類(lèi)的28S rRNA（28S）基因片段進(jìn)行測(cè)序和對(duì)比，分析這些序列的特征及遺傳系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以獲得能夠準(zhǔn)確鑒定這些蚧蟲(chóng)種類(lèi)的分子方法，為研究其他蚧蟲(chóng)種類(lèi)的分子鑒定方法提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 昆蟲(chóng)標(biāo)本

本試驗(yàn)所用的蚧蟲(chóng)標(biāo)本由廣東林業(yè)科學(xué)研究院、憑祥海關(guān)、石家莊海關(guān)、南通海關(guān)等單位提供，所有標(biāo)本均經(jīng)南京海關(guān)動(dòng)植食中心實(shí)驗(yàn)室鑒定（表1）。

1.2 提取基因組DNA

采用北京金麥格生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)的GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒提取各樣品的基因組DNA。提取方法：用雙蒸水沖洗100%乙醇浸泡的蚧蟲(chóng)樣品（應(yīng)少于30 mg），轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，置于MM400球磨儀研磨30 s（30次/s）后，12 000 r/min離心 10 min。離心后加180 mL裂解緩沖液及20 mL Proteinase K，放于55 ℃水中溫浴10 min。再加 200 mL 無(wú)水乙醇、200 mL緩沖液、20 mL磁珠，用磁珠來(lái)吸附基因組DNA，然后加500 mL Wash Buffer去雜。最后加20 μL Elution Buffer，靜置5 min后洗脫磁珠就獲得了樣品的基因組DNA溶液[12]。

1.3 28S片段擴(kuò)增和測(cè)序

在ProFlexTM PCR儀（購(gòu)自ABI公司）上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)采用25 μL體系，其中2 μL MgCl2 （25 mmol/L），2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL，購(gòu)自TaKaRa公司），上、下游引物（10 μmol/L，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成） 各0.5 μL，加滅菌水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃保持1 min，設(shè)置35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min。反應(yīng)完畢將PCR產(chǎn)物送到南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。本試驗(yàn)PCR反應(yīng)采用的引物為D2-3566F和D2-4068（表2）。

1.4 序列分析和建樹(shù)

將測(cè)得的28S序列導(dǎo)入SeqMan分析軟件中進(jìn)行拼接及校正。利用NCBI中的Blast工具搜索相似性序列， 以確認(rèn)序列的方向和可信度。再將所測(cè)序列全部載入Clustal X 1.83軟件中進(jìn)行比對(duì)[13]。將序列比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA 5.05軟件中[18]算出蚧蟲(chóng)種類(lèi)間的轉(zhuǎn)換/顛換（R）、變異位點(diǎn)（V）、保守位點(diǎn)（C）等[12，14]。最后使用MEGA 5.05軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)1 500次。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA凝膠電泳結(jié)果

本試驗(yàn)對(duì)10種蚧蟲(chóng)樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖1可知，10個(gè)樣品在720 bp附近均有清晰明亮、特異性好的條帶，且沒(méi)有非特異性條帶出現(xiàn)，可滿足后續(xù)基因測(cè)序的需要。

2.2 蚧蟲(chóng)28S序列解析

2.2.1 28S序列特征

將各序列導(dǎo)入MEGA 5.05軟件，均切成同等長(zhǎng)度片段（684 bp）。結(jié)果表明，共有變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別為226、454、150、75個(gè)。另外，統(tǒng)計(jì)所有位點(diǎn)堿基的平均含量（表3）發(fā)現(xiàn)，A的平均含量為16.7%，T（U）的平均含量為21.7%，G的平均含量為340%，C的平均含量為27.7% 。其中，G含量最高，A含量最低，C和G含量較接近，且C+G含量為61.7%，要高于A+T含量（38.4%），表現(xiàn)為明顯的C+G堿基偏嗜，與高A+T含量的昆蟲(chóng)線粒體基因堿基組成基本特征有所不同[14]。

2.2.2 堿基替換規(guī)律分析

使用MEGA 5.05軟件，計(jì)算全體位點(diǎn)及各位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換與顛換值以及其比值，結(jié)果表明，全體位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在C與T間，顛換主要發(fā)生在G與C之間，轉(zhuǎn)換/顛換比值（R值）為1.35。通過(guò)對(duì)密碼子各位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在密碼子的第1位點(diǎn)上，顛換主要發(fā)生在密碼子的第3位點(diǎn)上。第1、2、3位點(diǎn)的R值分別為1.72、1.45、1.02。無(wú)論整體還是密碼子的各位平均21.727.716.734.0638.9

點(diǎn)，其R值均小于2，說(shuō)明該段序列轉(zhuǎn)換與顛換未達(dá)到飽和，在探索系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)應(yīng)考慮轉(zhuǎn)換和顛換的發(fā)生比率;且說(shuō)明該段基因可靠度高，使用該基因得到的進(jìn)化樹(shù)也較為可靠（表4）。

2.2.3 基于28S序列的遺傳距離

基于Kimure 2-parameter 模型分析10種蚧蟲(chóng)個(gè)體的遺傳距離，將轉(zhuǎn)換與顛換考慮在內(nèi)，采用Bootstrap值（1 500次）進(jìn)行檢驗(yàn)[15]。由表5可知，相近種類(lèi)的遺傳距離數(shù)值在0.017～0.067之間，其中H.cyanophylli和 H.rapax的距離最小，為0.017;不隸屬于同一個(gè)科的種類(lèi)遺傳距離較遠(yuǎn)，數(shù)值一般在0.248～0.347之間，其中C. hesperidum和H. pitysophila的距離最大，為0.347（表5）。結(jié)果表明，同隸屬于盾蚧科的松突圓蚧及其相近種類(lèi)的遺傳距離較小，而隸屬于不同科的種類(lèi)之間的遺傳差距較大，呈現(xiàn)出較為明顯的遺傳差異性，可將此段序列作為分析及鑒別物種的依據(jù)，此結(jié)論與基于COⅠ序列計(jì)算的遺傳距離結(jié)果相一致。

2.2.4 建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

利用 MEGA 5.05軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，由圖2可知，H. cyanophylli與H. rapax聚為一小枝，且與H. lataniae聚為一枝;H. pitysophila與H. palmae聚為一小枝，上述2枝又聚為一大枝。而同屬于圓盾蚧亞科（Aspidiotinae）下的圓盾蚧屬種類(lèi)A. nerii、褐圓盾蚧屬種類(lèi)C. dictyospermi、蹄圓盾蚧屬種類(lèi)A. aurantii由近及遠(yuǎn)與圓盾蚧亞科種類(lèi)形成的大枝聚在一起。? 此外， 粉蚧科（Pseudococcidae）種類(lèi)P. lilacinus、蠟蚧科（Coccidae）種類(lèi)C. hesperidum明顯位于外枝。上述結(jié)果表明，同隸屬于圓盾蚧亞科櫛圓盾蚧屬（Hemiberlesia）下的各個(gè)種類(lèi)親緣關(guān)系最近，同隸屬于圓盾蚧亞科不同屬的種類(lèi)親緣關(guān)系次之，而隸屬于不同科的種類(lèi)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)， 這與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)方法的結(jié)果一致。同時(shí)，此結(jié)果也說(shuō)明28S基因在蚧蟲(chóng)種間有很好的Bootstrop支持率，能將同屬的蚧蟲(chóng)聚在一起，將不同科屬的蚧蟲(chóng)區(qū)分清楚，從而成功地鑒定出上述10種蚧蟲(chóng)，因此很適合作為DNA條形碼應(yīng)用于松突圓蚧及相似種類(lèi)的分子鑒定工作。

3 結(jié)論與討論

28S rRNA基因含有較多既相對(duì)保守又有足夠變異的遺傳信息位點(diǎn)，常被當(dāng)作DNA條形碼用于物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中[8-9]。Geoffrey等對(duì)盾蚧科 2 個(gè)亞科 5 個(gè)族，47 個(gè)屬 89 個(gè)種的 91 個(gè)標(biāo)本基于核基因 EF-lα 和 28S rRNA 進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析[10]。該研究是第1次針對(duì)盾蚧科類(lèi)群采用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析。Deng等以蠟蚧科的 6種蠟蚧為靶標(biāo)，對(duì)比 DNA 條形碼序列與 28S 基因序列在鑒定上述介殼蟲(chóng)種類(lèi)上的有效性，結(jié)果表明，利用 DNA 條形碼序列鑒定的結(jié)果與形態(tài)鑒定的結(jié)果一致，更適合應(yīng)用于同屬介殼蟲(chóng)鑒定[16]。

近年來(lái)，隨著我國(guó)外向型經(jīng)濟(jì)水平的持續(xù)提升，各口岸進(jìn)出口種苗花卉量劇增。我國(guó)口岸從進(jìn)口種苗花卉中截獲的蚧蟲(chóng)種類(lèi)、數(shù)量也出現(xiàn)了增長(zhǎng)，但這些蚧蟲(chóng)多以卵、若蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、樣本受損等狀態(tài)出現(xiàn)，用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法存在著較大的困難。用28S rRNA基因片段作DNA條形碼用于昆蟲(chóng)種類(lèi)的分子鑒定，極大程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷。

本研究通過(guò)對(duì)松突圓蚧及相近種類(lèi)共10種蚧蟲(chóng)的28S基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該序列既可有效區(qū)分蚧蟲(chóng)種類(lèi)，又能提供豐富的物種親緣關(guān)系信息。建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中包含的信息與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符。本試驗(yàn)結(jié)果不僅能對(duì)蚧蟲(chóng)28S rRNA基因序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充和完善，也能為下一步將28S rRNA基因分析方法應(yīng)用于口岸多種蚧蟲(chóng)種類(lèi)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究提供基礎(chǔ)。值得關(guān)注的是，由于不同的基因含有不同的遺傳進(jìn)化信息，也具有不相同的遺傳進(jìn)化速率，因此，在后續(xù)的蚧蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中，為得到更精確的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，還需要在結(jié)合多個(gè)基因分析，多種成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)形態(tài)特征及多種建樹(shù)方法等方面繼續(xù)努力。

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