王琪　雷秀娟　張浩　王英平

摘要：原生質(zhì)體因打破了細(xì)胞壁的限制，成為遺傳轉(zhuǎn)化和體細(xì)胞雜交的理想受體。為了以酶解法制備高產(chǎn)量、高活力的三七原生質(zhì)體，基于組織培養(yǎng)技術(shù)，以三七的愈傷組織為試驗材料，設(shè)置不同纖維素酶和果膠酶的濃度配比，同時探究三七愈傷組織不同培養(yǎng)天數(shù)、不同酶解時間、酶液不同滲透壓以及離心純化收集原生質(zhì)體時不同離心力對原生質(zhì)體制備的影響，確定三七愈傷組織原生質(zhì)體分離的最佳條件，以獲得較高產(chǎn)量和活力的原生質(zhì)體材料。結(jié)果表明，三七愈傷組織繼代培養(yǎng)15 d，酶液組成為15 mg/mL纖維素酶+7 mg/mL果膠酶+CPW液+0.7 mol/L甘露醇，酶解時間為 7 h，以800 r/min離心收集原生質(zhì)體時其產(chǎn)量和活力較高。

關(guān)鍵詞：三七;原生質(zhì)體;酶解法;純化;原生質(zhì)體活力

中圖分類號： S567.23+6.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0045-03

收稿日期：2019-12-05

基金項目：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（編號：CAAS-ASTIP-2016-ISAPS）。

作者簡介：王 琪（1995—），女，山東淄博人，碩士研究生，從事基因編輯與原生質(zhì)體融合研究。E-mail：1453865882@qq.com。

通信作者：王英平，博士，研究員，從事藥用植物資源與育種研究。E-mail：yingpingw@126.com。

原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后被質(zhì)膜包裹的有生活力的細(xì)胞，具有細(xì)胞全能性[1]。因沒有細(xì)胞壁的限制，原生質(zhì)體成為遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞雜交、新型育種的理想材料之一[2]。三七是五加科人參屬的一種極具藥用價值的草本植物，主產(chǎn)于我國云南省，具有活血化瘀、消腫定痛的功效[3]。本試驗對三七原生質(zhì)體的制備條件進(jìn)行研究，以期為三七的轉(zhuǎn)化試驗和雜交育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

試驗儀器主要有臺式冷凍離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、超凈工作臺、恒溫振蕩器、血球計數(shù)板、高壓滅菌鍋、電子天平、恒溫水浴鍋等。

1.2 主要試劑

試驗試劑主要有纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司）、果膠酶（上海源葉生物科技有限公司）、甘露醇（美國Sigma公司）、熒光素雙醋酸酯（FDA）（美國Sigma公司）、細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液（CPW液）（27.2 mg/L KH2PO4、101.0 mg/L KNO3、1 480.0 mg/L CaCl2·2H2O、246.0 mg/L MgSO4·7H2O、0.16 mg/L KI、0.025 mg/L CuSO4·5H2O ）、蔗糖、瓊脂粉、天門冬氨酸（Asp）、核苷酸、氫氧化鈉、水解乳蛋白（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 三七愈傷組織繼代培養(yǎng)

試驗所用的三七愈傷組織為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所誘導(dǎo)培養(yǎng)。挑選質(zhì)地較軟、易于分散、顏色鮮黃、生長狀態(tài)一致的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+8 mg/L Asp+8 mg/L 核苷酸+0.5 g/L水解乳蛋白+60 g/L 蔗糖+5.5 g/L 瓊脂，繼代后的同一批材料分別暗培養(yǎng)5、10、15、30、40、60 d，探究三七愈傷組織不同的培養(yǎng)時間對于原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。

1.3.2 三七原生質(zhì)體分離

以酶解法分離原生質(zhì)體時，其產(chǎn)量和活力受酶的種類、酶液配比、酶解時間、滲透壓等多方面因素的影響[4]。原生質(zhì)體分離的基礎(chǔ)條件為1%纖維素酶+0.5%果膠酶+13%CPW液[5]，暗酶解6 h并以600 r/min轉(zhuǎn)速純化原生質(zhì)體。對纖維素酶和果膠酶的濃度配比、酶解時間、甘露醇濃度設(shè)置不同水平進(jìn)行單因素試驗，每組設(shè)3次重復(fù)。酶液用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為58～60，附加0.3 mmol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）緩沖液作為pH值穩(wěn)定劑，酶液經(jīng) 0.22 μm 過濾器過濾滅菌使用。酶解前將酶液于37 ℃ 進(jìn)行預(yù)熱活化，愈傷組織中酶液加入量為 10 mL/g，在100 r/min轉(zhuǎn)速的搖床上振蕩酶解，酶解溫度為25 ℃。

1.3.3 原生質(zhì)體純化

以離心沉淀的方式對原生質(zhì)體進(jìn)行純化。將酶解產(chǎn)物經(jīng)100 μm濾網(wǎng)過濾，除去較大的或酶解不完全的細(xì)胞團(tuán)，收集濾液。將濾液離心2 min，用移液器回收上清酶液。向離心管底部沉淀加入10 mL CPW液，離心洗滌2 min棄上清，重復(fù)2次。用10 mL液體培養(yǎng)基離心1 min，洗滌原生質(zhì)體1次。用5 mL培養(yǎng)液重懸原生質(zhì)體。設(shè)置離心轉(zhuǎn)速為200、400、600、800、1 000、1 500、2 000 r/min 等7個水平，離心收集原生質(zhì)體后觀察其形態(tài)并計算產(chǎn)量。

1.3.4 原生質(zhì)體產(chǎn)量計算

用25×16血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)[6]。將純化收集的原生質(zhì)體溫和顛倒幾次混勻后，吸取1.0 mL用培養(yǎng)液稀釋3～5倍，取10 μL 滴加在計數(shù)板上，每個樣品計數(shù)3次取平均值。原生質(zhì)體數(shù)（個/mL）=80個小格內(nèi)原生質(zhì)體數(shù)÷80×400×10 000×稀釋倍數(shù)，原生質(zhì)體產(chǎn)量（個/g）=原生質(zhì)體數(shù)（個/mL）×純化懸浮體積÷酶解材料質(zhì)量。

1.3.5 原生質(zhì)體活力檢測

以熒光雙醋酸酯（FDA）染色法檢測原生質(zhì)體活力[7]。FDA用丙酮溶液配制，使用濃度為5 mg/mL，取1 mL純化后的原生質(zhì)體加入25 μL丙酮-FDA溶液，染色5～10 min，吸取100 μL制片，在熒光顯微鏡495 nm波長下進(jìn)行觀察統(tǒng)計，有活力的原生質(zhì)體在視野下呈現(xiàn)綠色熒光且活力越高熒光越強(qiáng)。每個試驗組取樣3次，每次觀察3個視野取平均值。原生質(zhì)體活力=視野內(nèi)發(fā)光細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)天數(shù)對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

取同一時間繼代，分別培養(yǎng)5、10、15、30、40、60 d 的三七愈傷組織各0.5 g，加入5 mL酶液，設(shè)3組重復(fù)，數(shù)據(jù)取平均值。在100 r/min轉(zhuǎn)速搖床上酶解6 h，經(jīng)CPW液洗滌2次，培養(yǎng)液洗滌1次，用5 mL培養(yǎng)液重懸并進(jìn)行計數(shù)，統(tǒng)計原生質(zhì)體的產(chǎn)量，以FDA染色法檢測原生質(zhì)體活力。結(jié)果（圖1）表明，對培養(yǎng)15 d的愈傷組織進(jìn)行酶解能獲得較高的產(chǎn)量和活力。培養(yǎng)30 d以后的愈傷組織產(chǎn)量和活力都明顯下降，原因可能是培養(yǎng)后期愈傷組織變得緊實(shí)密集，不易分散導(dǎo)致酶解不完全，且長時間不更換培養(yǎng)液，所需營養(yǎng)成分缺失，細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞活力下降。

2.2 不同離心轉(zhuǎn)速對原生質(zhì)體產(chǎn)量和完整度的影響

將繼代培養(yǎng)15 d的3 g愈傷組織用鑷子分散，加入30 mL酶液，在100 r/min轉(zhuǎn)速搖床上暗培養(yǎng)酶解 6 h，溫和顛倒混勻后用移液器吸4 mL培養(yǎng)液至7支15 mL離心管中，分別以200、400、600、800、1 000、1 500、2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，對酶解的原生質(zhì)體進(jìn)行洗滌純化。用CPW液洗滌2次，用培養(yǎng)液洗滌1次，加入5 mL培養(yǎng)液重懸原生質(zhì)體，取1 mL懸浮液稀釋3倍，再吸取10 μL于血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)并觀察原生質(zhì)體完整度，試驗重復(fù)3次。由表1可知，將離心轉(zhuǎn)速設(shè)為800 r/min時可以獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量，且完整度較高。分析原因可能是離心轉(zhuǎn)速較低時，原生質(zhì)體沉集不完全，會在純化過程中隨上清液流失;離心轉(zhuǎn)速較高時會增加原生質(zhì)體與管壁的碰撞次數(shù)和壓力，導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂，細(xì)胞完整度下降，碎片增加且產(chǎn)量降低。

2.3 不同滲透壓對原生質(zhì)體分離的影響

取繼代15 d的3 g愈傷組織用鑷子分散，加入30 mL酶液，取7支離心管，每管分裝4 mL酶解液，分別按0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mol/L加入對應(yīng)濃度的甘露醇，在100 r/min轉(zhuǎn)速搖床上暗培養(yǎng)酶解6 h。結(jié)果（圖2）表明，甘露醇濃度在0.2～0.4 mol/L 之間時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力很低，分析原因可能是該濃度的滲透壓相對于組織細(xì)胞過低，顯微鏡下很多細(xì)胞體積膨脹，細(xì)胞質(zhì)外流，細(xì)胞破裂;甘露醇濃度在0.5～0.7 mol/L之間時，隨著滲透壓增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力逐漸增加，顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)多為球形，細(xì)胞形態(tài)較為穩(wěn)定;甘露醇濃度繼續(xù)增加后細(xì)胞體積減小，原生質(zhì)體皺縮，產(chǎn)量和活力都下降，且在濃度為1.0 mol/L時產(chǎn)量大幅減少，活力也極低。因此以0.7 mol/L濃度的甘露醇調(diào)節(jié)酶液滲透壓時能獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力。

2.4 不同酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響

取培養(yǎng)15 d的0.5 g愈傷組織于5 mL酶液中酶解，材料的酶解時間設(shè)置7個水平，分別為3、5、7、8、9、11、13 h。在對應(yīng)的培養(yǎng)時間取樣進(jìn)行原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的計算。如圖3所示，隨著酶解時間的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。酶解3 h左右在顯微鏡下能觀察到較多大的細(xì)胞團(tuán)，游離的細(xì)胞數(shù)量少，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力較低;酶解5～9 h時，原生質(zhì)體的釋放量逐漸增多，但活力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;酶解9 h后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯降低，顯微鏡下細(xì)胞碎片增多，活力急劇下降。酶解7 h與酶解8 h時原生質(zhì)體的產(chǎn)量差異不明顯，但酶解7 h時原生質(zhì)體的活力較高。高活力的原生質(zhì)體更有利于后期的培養(yǎng)和應(yīng)用，因此將酶解7 h設(shè)為最佳酶解時間。

2.5 不同酶液配比對原生質(zhì)體分離的影響

纖維素酶液濃度（質(zhì)量體積比）設(shè)置3個水平，分別為10、15、20 mg/mL，果膠酶液濃度（質(zhì)量體積比）設(shè)置3個水平，分別為5、7、9 mg/mL，共計9種不同的酶液組合，酶解7 h后計算原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。如表2所示， 當(dāng)纖維素酶濃度為20 mg/mL、

果膠酶濃度為7 mg/mL時，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)到682×105個/g，但活力僅為33.7%;當(dāng)纖維素酶濃度為15 mg/mL、果膠酶濃度為7 mg/mL時，原生質(zhì)體產(chǎn)量為644×105個/g，活力達(dá)到59.6%;當(dāng)纖維素酶濃度為15 mg/mL，果膠酶濃度分別為7、9 mg/mL 時，二者的產(chǎn)量差異不明顯，但原生質(zhì)體的活力差異明顯。原生質(zhì)體的數(shù)量可以通過富集提高，而活力較高的原生質(zhì)體更有利于后期的培養(yǎng)和應(yīng)用，綜合考慮，將最佳酶液配比組合設(shè)置為 15 mg/mL 纖維素酶+7 mg/mL果膠酶。

3 討論與結(jié)論

原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力受多種因素的影響，如材料的基因型和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分、制備方式、制備條件等。本研究以酶解法分離三七原生質(zhì)體，將繼代培養(yǎng)15 d的材料在15 mg/mL纖維素酶+7 mg/mL 果膠酶+CPW液+07 mol/L 甘露醇的酶液中酶解7 h，并以800 r/min純化收集原生質(zhì)體時，能獲得較為理想的原生質(zhì)體材料，產(chǎn)量為 6.44×105個/g，活力為59.6%。試驗結(jié)果為下一步進(jìn)行原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化和原生質(zhì)體的培養(yǎng)再生奠定了基礎(chǔ)。

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