肖明雅，馮娜娜，陳 陽(yáng)，尹 銳

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院 132101）

1 引言

食品中動(dòng)物物種成分的正確標(biāo)注，可提升食品安全、食品質(zhì)量，增強(qiáng)消費(fèi)者的消費(fèi)信心、維護(hù)商業(yè)公平，保障食品行業(yè)的健康發(fā)展。 當(dāng)今社會(huì)，食品生產(chǎn)、加工和流通鏈條較長(zhǎng)，使得食品摻假的機(jī)會(huì)明顯增多。 一些不法商家為了謀取暴利，將價(jià)格較低的肉摻入價(jià)格較高的肉制品中出售[1]，如以雞肉冒充豬肉，豬肉冒充牛羊肉[2]。 更為嚴(yán)重的是近幾年頻頻曝出了“利用老鼠、狐貍、水貂肉添加明膠、胭脂紅等冒充牛肉”[3]等。 因此，建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的食品中牛源性檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。

基于蛋白質(zhì)[4-6]和基于DNA 技術(shù)[7-12]的檢測(cè)是動(dòng)物物種鑒定的主流方法。 蛋白質(zhì)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行，但是食物中的蛋白質(zhì)經(jīng)深加工和熱處理易發(fā)生變性而無(wú)法檢出。與蛋白質(zhì)相比，DNA 具有較高的熱穩(wěn)定性和物種特異性， 可對(duì)不同深加工方式的食物中的物種成分有效檢出[13,14]。 因此，越來(lái)越多的檢測(cè)手段開(kāi)始著眼于DNA 水平檢測(cè)的研究。

PCR 法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)由于檢測(cè)快速、 靈敏性高、特異性好等優(yōu)勢(shì)，被更多的用于動(dòng)物物種的檢測(cè)研究[15-20]。 根據(jù)PCR 檢測(cè)基本原理，本研究對(duì)待測(cè)引物及探針進(jìn)行獨(dú)特設(shè)計(jì)，以牛源性成分的快速檢測(cè)為切入點(diǎn)， 建立了一種食品中牛源性成分PCR 快速檢測(cè)方法。 該方法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)[21,22]等優(yōu)點(diǎn)，以期成為一種新型的物種成分快速分子檢測(cè)工具，在牛源性成分檢測(cè)、摻假鑒定及物種溯源過(guò)程發(fā)揮重要作用。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

2.1.1 材料與試劑

瓊脂糖、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker A（25～500bp）、磁珠法動(dòng)物基因組DNA 提取試劑盒、PCR 預(yù)混液 （上海生工生物工程股份有限公司）。

實(shí)驗(yàn)樣本于長(zhǎng)春某大型超市選購(gòu)，包括牛肉、羊肉、雞肉、豬肉、鴨肉、魚肉及28 份商業(yè)樣品。

2.1.2 主要儀器設(shè)備

TG16KR 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （上海繼譜電子科技有限公司）；PCR-MGL96+普通PCR 儀（日本島津公司）；SCANDRPO 100超微量核酸蛋白測(cè)定儀 （德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）；E-Gel Imager 核酸凝膠成像系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品DNA 提取及純度檢測(cè)

將每個(gè)肉的樣品切碎并精確稱重； 每個(gè)樣品按動(dòng)物基因組DNA 提取試劑盒提取0.1g， 然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行樣本DNA 的提取。 DNA 樣品的完整性用1%瓊脂糖凝膠電泳法鑒定； 樣品的純度用超微量核酸蛋白測(cè)定儀在OD260/OD280 處的吸光度值來(lái)確定，數(shù)值在1.7～1.9 的可用于PCR 反應(yīng)。

2.2.2 引物的設(shè)計(jì)

從國(guó)家生物技術(shù)信息中心 （national center for biotechnology information，NCBI) 網(wǎng)站下載牛和其他動(dòng)物物種的線粒體DNA 序列。 物種線粒體基因組Genbank 號(hào)如下：

Bos taurus (GU947021，AY126697，F(xiàn)J997262，KR011113，NC_036020)，Equus caballus (AP013085，AY584828，KT368757)，Equus asinus (MK982180)，Ovis aries (KU575248，KF312238，KX609626)，Capra hircus (MK234706，MH229952)，Sus scrofa(KY964306，MK251046，GU147934，MK248682)，Canis lupus familiaris (CM016608，KT591870，EU408280)，Gallus gallus (KX987152，GU261718)，Pandalus borealis (FJ403244)，Austruca lactea (NC_042401)，Parasesarma affine(NC_039990)，Anas platyrhynchos (MF069251，EU755252）。 對(duì)這些序列通過(guò)Vector NTI Advance11.0 進(jìn)行分析(Ink/Thermo Fisher Scientific Carsbad，CA，USA)，進(jìn)行多序列比對(duì)，選用跨牛線粒體基因組的ND5-ND6基因（煙酰胺嘌呤二核苷酸（nicotinamide dinucleotide，NADH）脫氫酶亞基5 和NADH 脫氫酶亞基6 編碼基因） 設(shè)計(jì)引物。 使用DNAStar 軟件對(duì)候選引物的物理參數(shù)進(jìn)行評(píng)估。 使用BLAST 工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對(duì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。 引物由生工（上海）生物工程有限公司合成。 序列如表1。

表1 引物序列

2.2.3 PCR 擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR 反應(yīng)體系25μL 包含5.2μL PCRMIX、 上下游引物各0.8μL(10μmol/L)、1μL 的DNA 模板和17.2μL 的ddH2O。 PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變 性5min，95℃變 性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸30sec，40 個(gè)循環(huán)。 取5μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 電泳條件為電壓100V，電流80mA；30min 后凝膠成像儀分析結(jié)果。

2.2.4 檢測(cè)的特異性

提取牛肉、羊肉、雞肉、豬肉、鴨肉、魚肉基因組DNA，以ddH2O 為陰性對(duì)照。應(yīng)用牛源性成分特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 驗(yàn)證反應(yīng)的特異性。

2.2.5 檢測(cè)的靈敏度

研究采用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)PCR 檢測(cè)技術(shù)的靈敏度。將純化的?；蚪MDNA 進(jìn)行梯度稀釋， 呈1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg 和1fg 7 個(gè)濃度， 分別以各濃度的DNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增； 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確定該檢測(cè)的靈敏度。 上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 驗(yàn)證檢測(cè)的靈敏度。

2.2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從超市購(gòu)買標(biāo)明成分的25 份牛肉及豬肉制品，按2.2.1 方法提取其基因組DNA，通過(guò)牛源性PCR-電泳檢測(cè)以評(píng)價(jià)其在實(shí)際樣本檢測(cè)中的適用性。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測(cè)的特異性

分別提取牛、羊、豬、雞、鴨、魚的基因組DNA，各DNA 樣本均稀釋至10ng/μL，通過(guò)牛源性成分特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 結(jié)果表明該方法對(duì)牛DNA 特異性檢出，其他物種無(wú)交叉反應(yīng)。 如圖1。

圖1 牛源性PCR-凝膠電泳特異性檢測(cè)結(jié)果

3.2 檢測(cè)的靈敏度

本研究采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 首先，通過(guò)PCR-凝膠電泳對(duì)10 倍梯度稀釋牛DNA進(jìn)行檢測(cè)，其最低檢測(cè)限達(dá)到10pg (圖2）。 因此，本研究建立的PCR 檢測(cè)方法的可以檢測(cè)10pg 以上的牛源性DNA 成分。

圖2 牛源性PCR-凝膠電泳檢測(cè)法的敏感度

3.3 商業(yè)樣品的檢測(cè)

提取25 份牛肉及豬肉待測(cè)樣品DNA， 通過(guò)牛源性成分PCR-電泳檢測(cè)，每個(gè)樣品做了一個(gè)平行樣。 所有的牛肉制品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)豬肉樣本檢測(cè)均呈陰性，如表2。 因此，該方法可以用于商業(yè)樣本中牛源性DNA 的檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究跨牛線粒體基因組ND5-ND6 基因設(shè)計(jì)引物，建立了一種食品中牛源性成分快速檢測(cè)方法。 該技術(shù)有望成為一種新型的物種成分快速分子檢測(cè)工具，在牛源性成分檢測(cè)、摻假鑒定及物種溯源過(guò)程發(fā)揮重要作用。