張召興，李佩國(guó)，張海龍，陳 玥，李蘊(yùn)玉，張香齋，賈青輝

(1.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066604；2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，河北 承德 067000)

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 唐山地區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)中16日齡病死的海蘭褐雛雞，無(wú)菌采集病死雛雞的肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2 主要試劑與儀器 普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯菌,均購(gòu)自北京路橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；Raid ID 32 STREP 陽(yáng)性菌鑒定試條，購(gòu)自Bio-Merieuxsa公司；DL-2 000 Marker，購(gòu)自北京中生瑞泰科技有限公司；2×TaqMarker Mix，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。ATB自動(dòng)化微生物生化鑒定系統(tǒng)由法國(guó)生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn)；梯度PCR儀由德國(guó)Eppendorf 公司生產(chǎn)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)；7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康1日齡海蘭褐雛雞70只，購(gòu)自秦皇島市金牧種雞場(chǎng)，飼養(yǎng)至16日齡進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 分離培養(yǎng)與鑒定 無(wú)菌采集病死雛雞的肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落接種于甘露醇氯化鈉鑒別培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h。挑取單個(gè)菌落分別接種于普通培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)，取純化培養(yǎng)的分離菌株進(jìn)行染色鏡檢。

1.5 生化試驗(yàn)鑒定 按照說(shuō)明書將純化培養(yǎng)的分離菌調(diào)整菌液濃度為2個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，接種于Raid ID 32 STREP 陽(yáng)性菌鑒定試條中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，用ATB自動(dòng)化微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化特性鑒定。

1.6 細(xì)菌16S rRNA的PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)細(xì)菌通用16S rRNA基因序列引物：5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqMix 25 μL,上、下游引物各2 μL,DNA模板3 μL，ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)其目的條帶，分離菌株的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較與分析。

1.7 致病性試驗(yàn) 取純化培養(yǎng)的分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度。將60只16日齡健康雛雞分為6組，每組10只，2～6組每只雛雞通過(guò)腹腔注射攻毒0.2 mL，濃度分別為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL和1.0×108CFU/mL；1組為對(duì)照組給予等量的生理鹽水，攻毒12 h后，觀察7 d，記錄其發(fā)病情況和死亡情況。用寇氏改良法計(jì)算分離菌株的半數(shù)致死量(LD50)。

1.8 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。

1.9 多重耐藥基因的PCR檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)葡萄球菌的多重耐藥基因cfr、fexA和fexB引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的分離菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分離菌株的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較與分析。

表1 多重耐藥基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 分離菌株在7%脫纖兔血培養(yǎng)基長(zhǎng)出了光滑的、邊緣整齊的菌落，形成透明的溶血環(huán)，呈現(xiàn)β溶血；在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形的、邊緣整齊的淺黃色菌落；在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出圓形的、邊緣整齊的白色菌落，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)變成金黃色的菌落；革蘭染色鏡檢，可見(jiàn)單個(gè)短鏈和成堆的葡萄串狀排列的陽(yáng)性球菌(見(jiàn)中插彩版圖1)。

2.2 細(xì)菌的生化鑒定 分離菌分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；分解馬尿酸鹽、還原硝酸鹽、精氨酸；不分解纖維二糖、阿拉伯糖；并水解淀粉、七葉苷；靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性；V-P試驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)生H2S。

2.3 細(xì)菌16S rRNA的PCR鑒定 分離菌株用16S rRNA PCR擴(kuò)增出大約為1 492 bp的PCR目的基因條帶(見(jiàn)圖2)。分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株金黃色葡萄球菌的基因序列同源性為98.9%～99.9%，分離菌株為金黃色葡萄球菌。

圖2 分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛雞攻毒后的48～72 h，個(gè)別雛雞出現(xiàn)死亡，在死亡試驗(yàn)雞的肝臟中分離到金黃色葡萄球菌，直到試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組試驗(yàn)雛雞無(wú)明顯的癥狀。2～5組的死亡率分別為30%、70%、90%和100%，其分離菌株的LD50為3.16×106CFU/mL。因此證實(shí)了從病死雛雞的體內(nèi)分離到的金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的致病性。

2.5 藥敏試驗(yàn) 由表2可知，分離菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢拉啶、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、林可霉素5種藥物敏感，對(duì)氨芐西林、阿莫西林、丁胺卡娜霉素、大觀霉素4種藥物中敏，對(duì)氟苯尼考、青霉素、新霉素、慶大霉素、多西環(huán)素5種藥物耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 多重耐藥基因的PCR檢測(cè) 由圖3可知，分離菌株均擴(kuò)增出了多重耐藥基因cfr和fexA目的基因的條帶。其PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株金黃色葡萄球菌的基因序列同源性為97.9%～99.8%，說(shuō)明了分離的金黃色葡萄球菌同時(shí)攜帶多重耐藥基因cfr和fexA。

圖3 分離菌株多重耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

葡萄球菌是人類和動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群，廣泛存在于空氣、飲水、飼料中及各種物品和人體的皮膚、黏膜、呼吸道、腸道中等，為環(huán)境中條件性致病菌，根據(jù)脂溶性色素的生化反應(yīng)可以分為腐生葡萄球、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌3種，其中，金黃色葡萄球菌主要引起雛雞急性敗血癥和關(guān)節(jié)炎[4-6]。魏曉巍等[6]報(bào)到了從病死的35日齡肉雞肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織中分離到致病性金黃色葡萄球菌。本試驗(yàn)從病死的16日齡雛雞體內(nèi)分離到了1株金黃色葡萄球菌，且對(duì)雛雞有很強(qiáng)的致病性，其LD50為3.16×106CFU/mL。葡萄球菌為環(huán)境中的條件致病菌，該菌可以通過(guò)直接接觸和空氣傳播，還可以通過(guò)創(chuàng)傷皮膚和黏膜傳播，雛雞也可以通過(guò)臍帶感染傳播[7-8]。因此，在雛雞養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)注意環(huán)境衛(wèi)生與消毒，加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理，減少籠內(nèi)的鐵絲等尖銳物品引起皮膚損傷感染該菌，同時(shí)減少外界應(yīng)激反應(yīng)、提高機(jī)體的抵抗力，減少該病的發(fā)生與流行。國(guó)內(nèi)關(guān)于肉雞的葡萄球菌病較多，蛋雛雞的葡萄球菌病報(bào)道較少。該菌可能對(duì)蛋雛雞存在潛在的威脅，應(yīng)引起重視。

S：敏感; I：中度敏感；R：耐藥

S:Sensitivity; I:Moderate sensitivity; R:Resistance