張 鵬，藺春恒，趙 欣，王 超

(1.沈陽工學(xué)院，遼寧 撫順 113122；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營(yíng)口 115009)

近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，許多化學(xué)合成藥物的毒副作用較大，這促使我們尋求療效好、副作用小的藥物來治療炎癥。中藥有著毒副作用較小和作用范圍較廣的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在有很多中藥成分已被證實(shí)具有一定的抗炎作用。黃芩湯首載于《傷寒論》，具有明顯的抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛作用。臨床上多用于痢疾、急性胃腸炎、腸炎、小兒腹瀉等癥[1]。急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)會(huì)引起非心源性腫脹，血氧不足，肺泡腔內(nèi)被大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺泡毛細(xì)血管的通透性增加，轉(zhuǎn)錄因子增加，促炎細(xì)胞因子和多形核中性粒細(xì)胞滲透性分泌顯著增多[2]，為研究黃芩湯對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用，本試驗(yàn)通過構(gòu)建脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)炎癥模型[3]，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、病理切片觀察、肺臟干濕重(W/D)測(cè)定等方法，探究黃芩湯的體內(nèi)抗炎作用，以期為開發(fā)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗炎中藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 昆明系雄性小鼠，100只，體重18～22 g，SPF級(jí)，購自遼寧省長(zhǎng)生生物有限公司。黃芩湯藥材，購自北京仟草藥業(yè)有限公司；LPS(46M4045V)，購自美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽地塞米松(J0912A)，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；白介素1β(IL-1β)試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒、白介素10(IL-10)試劑盒，均購自美國(guó)eBioscience公司；蘇木素-伊紅染液，購自上海信帆生物科技有限公司；其他試劑，均購自江西平海生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)分組與飼養(yǎng)管理 100只小鼠飼養(yǎng)3 d環(huán)境適應(yīng)后進(jìn)行試驗(yàn)，其中40只用來篩選黃芩湯濃度梯度，余下60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為黃芩湯高、中、低3個(gè)劑量組、空白對(duì)照組、LPS對(duì)照組和地塞米松(Dex)對(duì)照組，5 d后測(cè)量小鼠肺支氣管灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-1β以及IL-10的含量。每組隨機(jī)取6只小鼠用于BALF收集和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，其余4只右肺用于組織病理切片及蘇木精-伊紅(H.E.)染色，左肺用于肺W/D測(cè)定。

1.3 黃芩湯的制備與稀釋 按照《傷寒論》中記載，稱取黃芩15 g、芍藥10 g、甘草10 g和大棗10 g，用藥材總量10倍體積的蒸餾水浸泡1 h后熬制，熬制1 h后過濾藥渣，將濾出藥渣加8倍體積的蒸餾水繼續(xù)熬制1 h，將2次藥液合并，濃縮為1 g/mL藥液。量取黃芩湯適量，加生理鹽水稀釋定容，稀釋倍數(shù)分別為640、320、160、80、40、20、10倍和5倍，4 ℃ 保存待用。

1.4 小鼠急性肺損傷模型建立及取樣 本試驗(yàn)采用濃度2 mg/(kg·bw)的LPS 10 μL滴鼻建立ALI模型[4-5]，造模6 h后，斷頸法處死小鼠，于頸部正中切口5 mm，分離出氣管。分3次吸取1.5 mL PBS，反復(fù)灌洗3次，取出80 μL的BALF置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 黃芩湯最適稀釋倍數(shù)篩選 將40只小鼠隨機(jī)試驗(yàn)共分8組，每組5只，在成功建立小鼠ALI模型后，連續(xù)灌喂不同濃度黃芩湯5 d，每次灌胃0.5 mL，第6天處死小鼠取BALF。每組藥物稀釋倍數(shù)分別為640、320、160、80、40、20、10倍和5倍；分別取每組小鼠肺灌洗液，離心后取BALF 800 μL，采用ELISA法檢測(cè)BALF中TNF-α含量，篩選最佳給藥劑量。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 肺組織病理切片及H.E.染色 灌喂黃芩湯5 d后，每組4只小鼠斷頸處死，不進(jìn)行灌洗，取右肺葉先放入生理鹽水中漂去表面血跡及殘留物，用濾紙擦干后立即浸入10%甲醛溶液中固定24 h[6]，通過常規(guī)操作進(jìn)行水洗、脫水、透明、浸蠟、切片、H.E.染色觀察其病理學(xué)特點(diǎn)。

1.6.2 肺W/D比值 灌喂黃芩湯5 d后，小鼠斷頸處死，取左肺上葉稱濕重，80 ℃恒溫干燥48 h至肺干重恒定，精密稱定，計(jì)算公式如下：肺W/D比值=肺濕重/干重。

1.6.3 檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子 試驗(yàn)分組同1.2，不同劑量黃芩湯組小鼠灌喂黃芩湯5 d，第6天處死小鼠取肺灌洗液，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，采用ELISA試劑盒方法檢測(cè)上清液中IL-10、TNF-α和IL-1β的含量。收集小鼠BALF，根據(jù)IL-10、IL-1β和TNF-α試劑盒說明書檢測(cè)待測(cè)指標(biāo)。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有數(shù)據(jù)需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析，經(jīng)過分析之后的各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均列入三線表中。

2 結(jié)果

2.1 黃芩湯最適稀釋倍數(shù)篩選 稀釋倍數(shù)分別為320、160、80、40、20、10倍和5倍的黃芩湯預(yù)處理的ALI小鼠的TNF-α含量測(cè)定結(jié)果見圖1。由圖1可知，黃芩湯稀釋倍數(shù)為20、10、5倍時(shí)，TNF-α的含量成劑量依賴性，隨著藥物稀釋倍數(shù)增加，TNF-α含量明顯增加，藥物稀釋20倍后，隨著稀釋倍數(shù)增加TNF-α含量變化不明顯，因此本試驗(yàn)將稀釋倍數(shù)為5、10、20倍的黃芩湯確定為黃芩湯高、中、低濃度。

圖1 黃芩湯對(duì)ALI小鼠的最適作用濃度篩選(n=5)

2.2 肺標(biāo)本H.E.染色 參照Mikawar K等[7]的方法對(duì)各組肺組織病理切片進(jìn)行評(píng)級(jí)，空白對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)完整，肺泡壁薄，有極少的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整(中插彩版圖2A)；LPS對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)模糊，肺間質(zhì)增寬，肺泡腔內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有出血，肺部炎癥明顯為“+++”級(jí)(中插彩版圖2B)；黃芩湯高劑量組肺部炎癥程度較輕，見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為“+”級(jí)(中插彩版圖2C)；黃芩湯中、低劑量組肺部炎癥較高劑量組明顯可見出血為“++”級(jí)(中插彩版圖2D，2E)；Dex對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，與空白對(duì)照組相似，少見炎癥細(xì)胞為“-”級(jí)(中插彩版圖2F)。

2.3 肺濕干重 如表1所示，LPS對(duì)照組與空白組比較差異極顯著(P<0.01)，說明小鼠急性肺損傷模型構(gòu)建成功，黃芩湯給藥組肺水腫情況具有藥物劑量依賴性，且高、中劑量組與模型組比較，具有顯著性差異(P<0.05)，因此高、中劑量黃芩湯能夠有效減輕小鼠肺水腫。

表1 黃芩湯對(duì)急性肺損傷小鼠的肺濕干重影響

2.4 黃芩湯對(duì)炎癥因子含量的影響 高、中、低濃度的黃芩湯作用于LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠后，TNF-α、IL-1β、IL-10等炎癥因子的含量測(cè)定結(jié)果見表2，黃芩湯高、中、低劑量組不同程度減少TNF-α、IL-1β含量，增加IL-10含量。

表2 黃芩湯對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠中細(xì)胞因子含量的影響

3 討論

目前，臨床上常用抗生素來治療急性肺損傷等相關(guān)疾病[8]。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)，抗生素有不同程度的副作用且易產(chǎn)生耐藥性，據(jù)報(bào)道全球急性肺損傷的病例仍持續(xù)上升，給患者及家屬帶來巨大痛苦。在動(dòng)物生產(chǎn)方面，呼吸道疾病尤其是下呼吸道疾病，在臨床上治療往往力不從心，隨著小動(dòng)物醫(yī)療行業(yè)的不斷發(fā)展，臨床上發(fā)現(xiàn)越來越多的發(fā)病因素可引起急性肺炎，例如常見的波氏桿菌、支原體、流感病毒等，這種炎癥的發(fā)生大多屬于級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如果沒有及時(shí)治療，一般預(yù)后不良。鑒于目前這種現(xiàn)象，越來越多學(xué)者投身于中草藥研究，希望從中尋覓良方。

近年來眾多學(xué)者研究中藥單體或者植物提取物對(duì)急性肺損傷的影響，據(jù)報(bào)道苘麻葉[9]、金蓮花總黃酮粗提物[10]、金銀花提取物[11]對(duì)小鼠ALI具有保護(hù)作用，這些藥物通過調(diào)控NF-κB和MAPK兩條信號(hào)通路，減少下游TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，從而達(dá)到防治急性肺損傷小鼠的效果。另有學(xué)者研究中藥單體姜黃素[12]、白藜蘆醇[13]、黃藤素[14]、槲皮素[15]時(shí)發(fā)現(xiàn)，該類藥物有提高機(jī)體免疫力、抗氧化、抗炎等作用，尤其是防治急性肺損傷小鼠，效果顯著。除此之外，還有部分學(xué)者研究中藥古方或復(fù)方對(duì)小鼠急性肺損傷的治療效果。例如麻杏石膏湯能夠降低小鼠肺毛細(xì)血管通透性并保護(hù)毛細(xì)血管內(nèi)膜，提高動(dòng)脈氧分壓，減少炎癥因子TNF-α的含量，達(dá)到對(duì)小鼠急性肺損傷炎癥的抑制作用[16]。王雪慧[17]研究發(fā)現(xiàn)，通腑湯可以降低小鼠急性肺損傷模型肺灌洗液中重要的前炎性因子TNF-α及促炎因子IL-6的含量，并抑制NF-κB p65 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎效果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量黃芩湯組抗炎作用最佳；中、高劑量的黃芩湯能顯著地減輕肺水腫程度，極顯著地降低小鼠肺灌洗液中TNF-α和IL-1β的含量，且極顯著地提高IL-10的含量。試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)內(nèi)外論文報(bào)道基本一致，因此本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)黃芩湯能顯著地影響小鼠急性肺損傷中細(xì)胞因子的分泌，抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展。本試驗(yàn)為后期研究抗炎機(jī)制提供可靠依據(jù)，同時(shí)為臨床有效防治炎癥相關(guān)疾病提供參考，為綠色中獸藥的研發(fā)打下基礎(chǔ)。