李玉燕，鞏新民，祝永華，左?？劬?，包丹丹，江 兵，李 月，郭龍宗

(山東益生種畜禽股份有限公司，山東 煙臺 264680)

傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是雞的一種病毒性的呼吸道傳染病，該病能引起雞的死亡率和產(chǎn)蛋量下降，給生產(chǎn)帶來嚴重損失[1]。其中種雞的ILT 發(fā)病呈世界性分布，世界上許多國家都有該病的發(fā)病報道[2-3]，該病在我國近幾年也呈流行趨勢，不斷有養(yǎng)殖場發(fā)生傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)感染的報道[4-6]。2019年6月，某種雞場雞群在8周齡時開始出現(xiàn)呼吸道癥狀，聽雞有呼嚕聲、呼吸困難、伸頸喘氣、咳嗽、怪叫。臨床剖檢死雞發(fā)現(xiàn)眼部周圍有黃色干酪樣滲出，喉頭、氣管內(nèi)出血，黏液增多，部分雞只氣管內(nèi)有血塊，疑似傳染性喉氣管炎病毒感染。該雞群未進行傳染性喉氣管炎病毒免疫。筆者采集死亡雞只氣管、肺、喉頭等組織樣品進行病毒的分離與鑒定，雞胚絨毛尿囊膜接種、瓊脂擴散試驗和PCR鑒定結(jié)果顯示，該種雞群發(fā)病為ILTV感染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、2 000 bp Marker、瓊脂糖、TAE，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。ILTV標準陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。ILTV疫苗株作為陽性對照，購自英特威公司，批號為94150010，有效期至2020年8月13日。SPF雞胚，購自山東益吉達生物科技有限公司。

1.2 病料處理 采集該種雞場疑似ILTV感染雞只的氣管、肺、喉頭等病料，加入滅菌生理鹽水研磨，直至成5%～10%的勻漿液，加入青霉素、鏈霉素4 ℃作用2 h，凍融3次。將懸液移至離心管中充分搖震后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌，用于接種雞胚。

1.3 病毒分離 將經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌的濾液經(jīng)絨毛尿囊膜(CAM)接種15枚10日齡SPF雞胚，每枚接種0.2 mL濾液，同時設(shè)生理鹽水對照組。37 ℃孵化箱孵育6 d，每天照蛋2次，觀察雞胚死亡情況，棄去24 h內(nèi)的死胚。于接種后第6天收集雞胚絨毛尿囊膜，觀察是否有痘斑。若第1代有痘斑，將雞胚絨毛尿囊膜研磨制成勻漿，反復(fù)凍融3次，離心取上清，置-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于提取DNA。若第1代沒有痘斑，按照同樣方式繼續(xù)傳至第3代。

1.4 瓊脂擴散試驗 用標準的ILTV陽性血清作為瓊脂擴散試驗抗體加入梅花孔中央，分離病毒毒株作為瓊脂擴散試驗抗原加入周圍孔。在1.5%的瓊脂板上，按照常規(guī)方法打孔、加樣，置37 ℃濕盒中24 h，觀察結(jié)果。

1.5 核酸提取 采集有痘斑病變的雞胚絨毛尿囊膜經(jīng)研磨離心后，取上清液按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit使用說明書提取DNA。

1.6 樣品的鑒定

1.6.1 引物 設(shè)計合成針對ILTV的通用PCR檢測引物，上游引物序列為：5′-GAGTTCGAGAACGATGACTC-3′，下游引物序列為：5′-AGGCAGATGTACGAGTTAGG-3′，擴增目的片段大小為530 bp。

1.6.2 目的片段的擴增 PCR反應(yīng)體系25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、模板DNA 3 μL、ddH2O 7.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存?zhèn)溆?。? μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 某種雞場雞群在8周齡開始出現(xiàn)呼吸道癥狀，聽雞有呼嚕聲、呼吸困難、伸頸喘氣、咳嗽、怪叫。該雞群未免疫傳染性喉氣管炎疫苗。臨床剖檢死雞發(fā)現(xiàn)眼部下方有黃色干酪樣滲出物，氣管內(nèi)出血，嚴重者氣管內(nèi)有出血斑塊，肺臟有大量黏液，疑似傳染性喉氣管炎病毒感染。

2.2 ILTV的病毒分離 將氣管、肺、喉頭等病料組織上清液過濾除菌后，經(jīng)絨毛尿囊膜(CAM)方式接種SPF 雞胚，第1代孵化雞胚于72 h內(nèi)死亡2枚，其余雞胚一直孵化至第6天，未有死亡。未死亡雞胚4 ℃凍存過夜后，取CAM進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAM增厚，有大小不等的白色、不透明痘斑出現(xiàn)，中間凹陷壞死。

2.3 ILTV的瓊脂擴散試驗 將分離ILTV出現(xiàn)痘斑病變的CAM的研磨液作為待測抗原，其和標準陽性血清之間出現(xiàn)明顯的沉淀線，可以確診所分離的病毒為ILTV。

2.4 ILTV 的 PCR鑒定 采集有痘斑病變的雞胚絨毛尿囊膜提取DNA，進行ILTV的PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增出530 bp的目的條帶(見圖1)，符合預(yù)期片段大小，可以確診所分離的病毒為ILTV。

圖1 有痘斑病變的雞胚絨毛尿囊膜的ILTV的PCR鑒定

3 討論

本試驗采集該種雞場雞群疑似感染ILTV雞只的喉頭、氣管和肺等病料進行病毒分離，經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜接種、瓊脂擴散試驗和PCR擴增對分離病毒進行鑒定。結(jié)果表明，所分離病毒為雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)。該雞群在疑似感染ILTV后，立即進行ILT緊急免疫，未造成嚴重經(jīng)濟損失，死亡率為0.6‰(1萬只雞死亡6只)。規(guī)?；B(yǎng)殖場ILT的防控主要以疫苗免疫接種為主，感染壓力小的地區(qū)種雞群一般在100日齡左右免疫1次可使雞群獲得終生的保護力，免疫方式以滴眼為主。該種雞群ILT發(fā)病周齡小，這在集約化養(yǎng)殖場中第1次發(fā)現(xiàn)，也為場區(qū)的生物安全防控敲響了警鐘。因此，在種雞群免疫ILT前應(yīng)加強場區(qū)的生物安全防控措施，包括場區(qū)的物資、車輛、人員的消毒管理以及雞舍通風(fēng)等方面，防止ILTV在種雞群免疫前侵入雞群。