林小云，戚露月,2*，章振林，岳 華

（1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院骨質疏松和骨病科 上海市骨疾病臨床研究中心，上海 200233；2.蘇州大學附屬第二醫(yī)院內分泌科，蘇州 江蘇 215004）

多發(fā)性內分泌腺瘤2型 （multiple endocrine neoplasia 2,MEN2）為常染色體顯性遺傳性疾病，其由Sipple[1]在1961年首先報道，故又被稱為Sipple綜合征。該病呈家族或散發(fā)性發(fā)病，發(fā)病率約為2.8/10萬[2]。臨床上，MEN2依據不同表型又可分為MEN2A、MEN2B及家族性甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）3種亞型，其中MEN2A（在線人類孟德爾遺傳數據庫171400）是最主要的亞型，占所有MEN2病例的55%[3]。目前，國外已報道超過1 000例的MEN2A散發(fā)或家系病例[4]，國內共報道80余例散發(fā)和90余例家系病例[5-8]。MEN2A患者的臨床表現為同時或先后出現2個或大于2個的特定性內分泌腺增生或腫瘤[9]，但因病變出現時間早晚不一而常被漏診，早期明確診斷MEN2A對患者治療方式的選擇以及遺傳干預有重要意義。

本研究對1個MEN2A家系進行臨床診療分析及致病基因鑒定，并結合相關文獻，探討MEN2A患者的臨床表現、診斷以及基因型與表型間的關系，旨在提高臨床醫(yī)師對此類少見內分泌疾病的認識。

資料與方法

一、資料

本研究經上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會批準，家系內所有參與研究的成員均簽署知情同意書。

先證者（Ⅱ-3）為33歲的女性，父母為非近親婚配，其為第三胎第三產，足月順產，出生時身長、體重與同齡兒相當，既往體健。先證者母親（Ⅰ-2）與妹妹（Ⅱ-4）在外院被診斷為MTC，分別于55歲和26歲去世，先證者的2個姐姐（Ⅱ-1和Ⅱ-2）均健康，無類似病史（見圖1）。

圖1 MEN2A家系圖

先證者因“骨痛1年余，加重1周”至我科就診。詢問病史，患者自述1年前出現雙膝疼痛，1周前出現雙髖疼痛，疼痛持續(xù)，不能自行緩解，下蹲、起立困難?；颊叱Ｓ斜忝?，夜間小便7～8次。體格檢查示，患者身高157.2 cm，體重38.0 kg，體質量指數為15.38 kg/m2；血壓140/80 mmHg，體溫36.6 ℃。實驗室檢查可見血鈣、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）和降鈣素等均升高（見表1）。雙能X射線吸收儀（豪洛捷公司，美國）測定第1腰椎至第4腰椎、股骨頸和全髖骨密度Z值分別為-5.4 SD、-5.1 SD和-5.3 SD?；颊呒谞钕偌凹谞钆韵貰超顯示，左側甲狀腺下極背側見實性低回聲腫塊，形態(tài)不規(guī)則，甲狀旁腺腫瘤可能；雙側甲狀腺多發(fā)結節(jié)；雙側頸部血管旁可見數個淋巴結。全身核素骨顯像結果顯示，全身多發(fā)骨代謝異常，顱骨彌漫性放射性攝取增高，呈“帽征”，兩側多發(fā)肋骨、雙側骶髂關節(jié)和雙側股骨對稱性放射性攝取增高，考慮為甲狀旁腺亢進（甲旁亢）骨病。遂以“多發(fā)性內分泌腺瘤”將患者收入外科病房，并行全身麻醉下左側甲狀旁腺腫瘤切除術、左側甲狀腺全部切除術、左側中央區(qū)頸淋巴結清掃術。術后標本經病理檢查診斷為左側MTC（直徑0.6 cm）；左側頸部中央區(qū)1枚淋巴結見癌轉移；左側甲狀旁腺腫瘤呈多結節(jié)性生長，腫瘤有寬帶樣纖維分隔，局部有包膜浸潤，考慮為左側非典型甲狀旁腺腺瘤。免疫組織化學檢測結果示，腫瘤細胞內癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、降鈣素、突觸生長蛋白、CD56和PTH均為陽性，嗜鉻粒蛋白A為部分陽性，TG、CK19和半乳凝素3均為陰性，腫瘤細胞增殖指數為2%。術后監(jiān)測患者的血降鈣素、PTH、鈣等指標（見表1）。術后常規(guī)予患者碳酸鈣D3片600 mg每日1次、骨化三醇0.25 μg每日1次治療。術后4周，先證者的雙髖疼痛較前稍緩解，運動功能改善。

表1 先證者術前、術后檢查結果

二、方法

1.RET基因突變檢測

（1）外周血基因組DNA提?。悍謩e采集先證者（Ⅱ-3）及其二姐（Ⅱ-2）外周血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中。用全血DNA提取試劑盒(上海萊楓生物科技公司)提取血樣本DNA，用TU-1900紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）檢測DNA濃度。

（2）PCR擴增及突變檢測：從在線數據庫（Gen-Bank檢索號NC_000010）中獲得RET原癌基因的DNA序列。引物采用在線Primer 3軟件設計（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），共21對，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物序列參照文獻[10]），采用PCR進行外顯子擴增。反應體系共20 μL，包括1×PCR預混液緩沖液Ⅰ（TaKaRa公司）9.5 μL，Mg2+（TaKaRa公司）1 μL，dNTP[捷瑞生物工程（上海）有限公司]1 μL，Hotstar Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）1 μL，上下游引物各1 μL，超純水4.5 μL，DNA樣本1 μL。PCR反應條件為，預變性95 ℃2 min，變性94 ℃20 s，退火58 ℃～68 ℃（根據不同引物調整）40 s，延伸72 ℃1 min，共35個循環(huán)；終端延伸72 ℃2 min。PCR產物經蝦堿性磷酸酶（Promega公司）和外切酶Ⅰ（EXO Ⅰ）（Epicentre公司）純化后，用美國應用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems International inc.）（ABI）的BigDye 3.1試劑盒及ABI 3730自動測序儀進行測序。測序文件用PolyPhred軟件進行分析，再結合人工校對，記錄后整理出結果。

2.致病性及保守性分析：利用在線PolyPhen 2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及 Mutation Master（http：//www.mutationtaster.org/）預測突變位點的致病性，使用UniProt（https：//www.uniprot.org/）軟件分析突變氨基酸在不同物種間的保守性。

結果

一、RET基因突變檢測

經Sanger法測序發(fā)現,先證者的11號外顯子發(fā)生雜合錯義突變c.1901G＞A（見圖2），其編碼的蛋白質第634位氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)槔野彼幔╬.Cys634Tyr）。先證者的健康姐姐及300例對照人群未發(fā)現上述基因突變位點。

圖2 先證者RET基因突變檢測結果

二、致病性及保守性分析

PolyPhen 2及Mutation Master軟件均預測該突變位點為致病突變，預測分數均為1.00 （見圖3）。UniProt軟件分析示，p.Arg634在不同物種間高度保守（見圖4）。

圖3 PolyPhen 2軟件預測突變位點的致病性

圖4 RET基因634位氨基酸保守性分析

討論

一、先證者與家系成員的診斷過程

本研究報道的MEN2A家系先證者以骨痛為首發(fā)癥狀，實驗室檢查顯示血鈣、PTH及降鈣素水平升高，B超檢查發(fā)現單側腎結石，最終經手術病理證實存在單側甲狀旁腺腺瘤和MTC，結合RET基因突變檢測結果，最終明確診斷為MEN2A。因先證者母親及妹妹先后在外院被診斷為MTC，由此推斷其母親及妹妹發(fā)病的分子遺傳學機制也可能為RET基因突變，故該家系為RET基因突變導致的MEN2A家系。

二、MEN2A患者的臨床表現及診斷

MEN2A是多發(fā)性內分泌腺瘤的一種亞型，臨床表現主要包括MTC、嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma，PCC）和原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥（primary hyperparathyroidism，PHPT）[9]，少數患者可出現肩胛間區(qū)皮膚苔蘚淀粉樣變和（或）先天性巨結腸[11]。在MEN2A患者中，MTC的發(fā)生率＞90%[3]，早期患者常無特殊癥狀，往往是經觸診和（或）甲狀腺影像學檢查時意外發(fā)現，檢測血清降鈣素水平以及甲狀腺超聲和甲狀腺結節(jié)細針穿刺細胞學檢查可確診[12]。PCC的發(fā)生率占MEN2A的40%～50%[3]，常為雙側、多發(fā)，患者臨床表現為陣發(fā)性高血壓、頭痛、心悸以及多汗等，可通過檢測血或24 h尿甲氧基腎上腺素及甲氧基去甲腎上腺素濃度進行定性診斷；CT或MRI檢查對PCC也有較好的診斷靈敏度，可用于定位診斷[13]；功能影像學定位則首選碘-123-間位碘代芐胍核素顯像，其診斷PCC的靈敏度為85%～88%[9,13-14]。若未發(fā)現腫瘤但定性診斷高度懷疑為PCC，則可進一步予行氟-18-二羥基苯丙氨酸正電子發(fā)射斷層成像，其檢出PCC的靈敏度可達81%～100%[15]。在MEN2A中，PHPT的發(fā)生率為10%～20%[9]，疾病隱匿，早期患者可出現口干、乏力、夜尿增多等癥狀，患者多因骨痛和（或）泌尿系結石癥狀而首診，測定血清游離鈣、PTH水平，并行甲狀旁腺B超或锝-99m-甲氧基異丁基異腈單光子發(fā)射計算機體層顯像以及全身核素骨顯像等輔助檢查，同時排除繼發(fā)性和散發(fā)性甲狀旁腺功能亢進后，方可診斷該病。

三、致病基因及發(fā)病機制

1993年，Donis-Keller等[16]首次報道了MEN2A是由RET原癌基因突變所致。RET原癌基因位于染色體10q11.2上，其編碼的酪氨酸激酶受體包含3個功能結構域——胞外配體結合域、疏水跨膜結構域和細胞質結構域[17]。其中，胞外配體結合域包含一個富含半胱氨酸區(qū)域，而高度保守的半胱氨酸結構域對于二硫鍵的形成至關重要；其細胞質結構域含10個磷酸化位點，可與共受體GFRα1～GFRα4結合，促使胞內酪氨酸殘基磷酸化，通過下游的信號轉導，調控細胞的增殖和分化。突變體通過半胱氨酸間的二聚體化或者基因的劑量效應（突變型的擴增或野生型的缺失）增強了RET酪氨酸激酶信號轉導的功能，激發(fā)細胞內酪氨酸激酶自動磷酸化，導致細胞過度增殖以及腫瘤生長[17]。迄今報道的導致MEN2A的基因突變均為RET原癌基因突變，且其中85%的突變位于第11外顯子634位點[18]，與本研究一致。另有報道顯示，少數突變位于第10外顯子的611、618、620位點和第11外顯子的631位點[2]。RET基因突變位點與MEN2A表型之間有著密切的聯系，美國甲狀腺協會[12]根據不同的RET突變位點將MTC風險分為中、高、極高3個等級。等級越高，意味著腫瘤侵襲能力越強，甲狀腺手術需要切除的范圍越大及預防性切除甲狀腺的年齡越小。位于第11外顯子的634密碼子p.Cys634位點突變（p.Cys634Arg或p.Cys634Gly、p.Cys634Phe、p.Cys634Ser、p.Cys634Trp、p.Cys634Tyr）屬于高風險，與攜帶其他突變位點的患者相比，攜帶該位點突變的患者除了發(fā)生MTC之外，同時伴有PCC、PHPT的可能性也最大。在MEN2A患者中，MTC表現出與年齡相關的外顯率[19-20]，據報道，最小的患者只有5歲[18]。因此，美國甲狀腺協會建議，該突變位點攜帶者盡可能在5歲之前進行預防性全甲狀腺切除術（包括或不包括中央淋巴結切除術），并盡快開始PCC和PHPT的篩查[12]。國內最常見的RET基因突變位點也是第11外顯子的634、611、620、768位點[21-22]。根據美國甲狀腺協學風險分級，611、620、768位點突變提示MTC侵襲力為中度風險，同時在MTC的基礎上發(fā)生PCC和PHPT的可能性較小，尤其是768位點突變。本研究報道的該家系先證者為高風險（p.Cys634Tyr），就診時甲狀腺及甲狀旁腺已經累及，術后病理檢查結果證實MTC已發(fā)生局部淋巴結轉移。因先證者在甲狀腺手術之后進行基因診斷，因此對于其殘存的右側甲狀腺進行了密切隨訪，包括血清降鈣素和癌胚抗原水平檢測以及頸部B超檢查等。盡管先證者術后短期隨訪顯示，上述指標在正常范圍之內（見表1），但結合其基因診斷，仍建議其進行預防性右側甲狀腺切除及右側中央區(qū)頸淋巴結清掃手術，先證者表示愿配合密切隨訪，但暫時拒絕再次手術。

四、隨訪及預后

MEN2A患者的預后主要由其MTC病情程度決定，相較PCC及PHPT，MTC具有進展快、易侵襲、術后易復發(fā)的特點。研究表明，MEN2A患者中，MTC伴有淋巴結轉移者的術后復發(fā)率高達50%[23]，并且復發(fā)風險可持續(xù)至術后20年左右[24]。因此美國甲狀腺協學指南推薦，MEN2A患者行MTC切除術后應進行長期隨訪，需每6個月監(jiān)測血癌胚抗原和降鈣素的水平。頸部體格檢查發(fā)現腫塊以及血生化檢測降鈣素升高的患者，需行頸部CT檢查以了解MTC復發(fā)情況[12]。MEN2A患者中，相較于MTC而言，PHPT惡性度低，手術可治愈，且術后復發(fā)率較低，約為4%[25]，患者的預后良好。但MEN2A患者可能同時存在2個或2個以上的甲狀旁腺腺體的增生，因此PHPT術后也應重視監(jiān)測血鈣和PTH以及早發(fā)現新發(fā)甲狀旁腺腺瘤或增生。MEN2A患者預后的關鍵是干預術后復發(fā)的侵襲性MTC，這也是近年來該病在國際上的研究熱點[26]。Elisei等[27]開展的一項前瞻性、隨機、安慰劑對照Ⅲ期臨床試驗表明，RET受體酪氨酸激酶抑制劑（卡博替尼）相對安慰劑能夠顯著延長侵襲性MTC成年患者的無進展生存期（11.2個月比4.0個月）。Chuk等[28]開展的一項Ⅰ期臨床試驗表明，卡博替尼能顯著降低侵襲性MTC兒童及青少年患者的降鈣素水平至基線的24%～87%。同時，對于攜帶RET基因突變且有生育要求的MEN2A患者，美國甲狀腺協會指南[12]建議進行體外受精，將排除RET基因突變的受精卵移植入宮內，通過遺傳干預，切實阻斷突變的RET基因在下一代傳遞。國內黃荷鳳院士研究團隊對攜帶RET基因突變的親代體外受精的受精卵進行RET基因單倍型篩選，對MEN2A患者的子代成功進行遺傳干預[29]。

總之，結合本研究報道的先證者及其家系成員的臨床特點及基因測序結果，先證者為RET基因突變導致的MEN2A診斷明確。結果提示臨床醫(yī)師應對MEN2A先證者及家系內成員進行積極的突變基因篩查，從而采取合理、全面的臨床干預措施，改善患者的預后及指導其生育。