劉君，米敏，郭方其，王驕陽(yáng)，黑銀秀*

(1.臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臺(tái)州 3170002； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021)

郁金香(TulipagesnerianaL.)是世界著名花卉，近年來(lái)郁金香展蓬勃發(fā)展，每年從荷蘭進(jìn)口的郁金香品種和數(shù)量急劇增長(zhǎng)。2019年僅江蘇省就從國(guó)外引進(jìn)300多個(gè)品種、3 000萬(wàn)粒郁金香種球用于郁金香文化月花海布置[1]。國(guó)內(nèi)花展用球幾乎都從國(guó)外進(jìn)口，造成大量外匯流失。

通過(guò)傳統(tǒng)分球方法進(jìn)行郁金香種球繁殖，繁殖系數(shù)較低且品種易退化[2]，而以郁金香鱗莖、花莖及其他材料為外植體，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行郁金香種球的快速繁殖，不僅能保持原品種的優(yōu)良特性，且繁殖系數(shù)高，是郁金香種球產(chǎn)業(yè)化繁育的重要手段。國(guó)外對(duì)郁金香組織培養(yǎng)的研究較多，主要以莖段[3-4]、腋芽[5-6]、球莖[7]、花莖[8]等作為外植體，且大部分研究都是先形成愈傷組織再分化出小芽。國(guó)內(nèi)快繁研究多以鱗莖作為外植體，以直接誘導(dǎo)分化小鱗莖或小芽為主，研究方向主要集中在環(huán)境調(diào)控、激素配比篩選上，但繁殖系數(shù)不高，還未能在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用[9]。本研究以郁金香鱗莖為外植體，研究不同取材時(shí)間、不同層鱗片誘導(dǎo)再生小鱗莖的效果，以期為郁金香的快速繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試郁金香品種為法國(guó)之光(Iie de France)，2018年12月至次年3月在臺(tái)州市農(nóng)科院小溪基地種植，4月采收種球，經(jīng)消毒風(fēng)干后置于溫度(20±2) ℃、濕度(60±5)%的貯藏室存放，9—11月在5 ℃冷庫(kù)存放。

1.2 消毒方式

挑選無(wú)病害郁金香種球，清理干凈并剝掉外層褐色種皮，用自來(lái)水沖洗5 min，于超凈工作臺(tái)上預(yù)備消毒。除進(jìn)行消毒方式篩選試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)消毒方式均采用75%酒精浸泡2 min取出，用無(wú)菌水沖洗2次及2%次氯酸鈉(NaClO)溶液浸泡20 min后取出，再用無(wú)菌水沖洗3次。

1.3 接種、培養(yǎng)與統(tǒng)計(jì)

將郁金香鱗片切成5～8 mm小塊進(jìn)行接種。采用MS基本培養(yǎng)基，含3%蔗糖和0.45%瓊脂粉，不同處理添加不同濃度激素，pH值調(diào)為5.8。每處理接8～10瓶，每瓶接4個(gè)外植體。培養(yǎng)條件為光照12 h·d-1，溫度(25±2)℃。觀察記錄鱗片生長(zhǎng)情況，1周后統(tǒng)計(jì)污染情況，30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)分化結(jié)果(不計(jì)污染，下同)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同消毒方式對(duì)郁金香鱗片污染率的影響

2019年2月18日，田間郁金香處于蕾期，采挖種球進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)消毒處理。T1為75%的酒精浸泡1 min，用無(wú)菌水沖洗2次，2%NaClO浸泡10 min，用無(wú)菌水沖洗2次。T2為75%酒精浸泡2 min，2%NaClO浸泡20 min，其他方式同T1。T3為75%酒精浸泡2 min，5%NaClO浸泡10 min，其他方式同T1。

1.4.2 不同層鱗片分化的差異

2019年3月27日田間植株處于更新球膨大期，取平均周徑大于10 cm的更新球作為試驗(yàn)材料。該階段更新球外面仍包著一層老鱗片，老鱗片干皺不飽滿。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，從外向內(nèi)分別取更新球的不同層鱗片，即外層鱗片(第1層)(后期會(huì)形成膜質(zhì)種皮保護(hù)種球)、中層鱗片(第2層)、內(nèi)層鱗片(第3層)、中心芽體(第4層)。將鱗片切成0.5 cm見方，凸面朝上接種到6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS培養(yǎng)基中。

1.4.3 帶有底盤的鱗片的分化情況

2019年7月31日，室內(nèi)貯藏的郁金香種球已完成花芽分化，取平均周徑大于10 cm的種球作為試驗(yàn)材料，此時(shí)種球最外層鱗片已完全褐化變?yōu)槟べ|(zhì)外皮。該試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，從外向內(nèi)分別取中層鱗片(第2層)、內(nèi)層鱗片(第3層)、中心芽體(第4層)進(jìn)行接種。將不同層的帶有底盤結(jié)構(gòu)的鱗片接種到6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上。

1.4.4 小鱗莖的增殖情況

將試驗(yàn)中誘導(dǎo)得到的小鱗莖轉(zhuǎn)接到6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察小鱗莖的生長(zhǎng)和增殖效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對(duì)郁金香鱗片成活的影響

由表1可見，隨著消毒時(shí)間的增加和NaClO濃度的升高，污染率逐漸降低。T3的鱗片污染率為10.17%，明顯低于T1和T2。但經(jīng)T3處理消毒的鱗片，培養(yǎng)4周后部分鱗片邊緣由乳白色變成為褐色，并逐漸死亡，可能是高濃度的NaClO對(duì)鱗片組織造成損傷。為了提高后期成活率，建議使用T2處理對(duì)郁金香鱗片進(jìn)行消毒。

表1 不同消毒方法對(duì)郁金香鱗片接種污染率的影響

2.2 不同層鱗片對(duì)愈傷誘導(dǎo)和小鱗莖再生的影響

培養(yǎng)2周后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，第1層鱗片開始膨大，并由白色轉(zhuǎn)為淡黃色，培養(yǎng)4周后，中心顏色變綠，邊緣變褐，60 d后沒有轉(zhuǎn)接的愈傷組織邊緣變黑直至死亡。表2表明，隨著接種鱗片部位由外向內(nèi)選擇，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸減小，而小鱗莖誘導(dǎo)率逐漸增大。第1層鱗片即外層鱗片的愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)88%，但未誘導(dǎo)出小鱗莖；第2層鱗片的大小和組織結(jié)構(gòu)沒有變化。第3和4層鱗片誘導(dǎo)小鱗莖效果明顯，其小鱗莖誘導(dǎo)率分別為25.00%和57.89%(圖1)。

表2 不同層鱗片對(duì)愈傷誘導(dǎo)和小鱗莖再生的影響

A、B、C、D分別為郁金香第3、4、1和2層鱗片培養(yǎng)4周后誘導(dǎo)出的小鱗莖和愈傷組織。圖1 不同層鱗片誘導(dǎo)分化出的愈傷組織和小鱗莖

2.3 帶有底盤的鱗片的分化情況

培養(yǎng)4周后調(diào)查發(fā)現(xiàn)(表3)，與2.2試驗(yàn)結(jié)果一樣，第2層鱗片組織基本沒有變化，既沒有誘導(dǎo)出愈傷也沒有誘導(dǎo)出小鱗莖。與2.2試驗(yàn)不同的是，無(wú)論第3層鱗片還是第4層鱗片都沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，但出現(xiàn)了很多綠葉組織(圖2)。第4層綠葉和小鱗莖誘導(dǎo)率都顯著高于第3層鱗片，其中葉片誘導(dǎo)率為31.67%，小鱗莖誘導(dǎo)效果更明顯，誘導(dǎo)率高達(dá)73.33%。

表3 不同層鱗片誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織及小鱗莖的比較

A、B為郁金香第4層鱗片培養(yǎng)4周后誘導(dǎo)出的小鱗莖；C、D為郁金香第4層鱗片培養(yǎng)4周后誘導(dǎo)出的綠葉組織。圖2 帶有底盤的不同層鱗片誘導(dǎo)分化出的小鱗莖和綠葉組織

2.4 小鱗莖的增殖情況

2019年7月31日將帶有郁金香小鱗莖的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基。圖3是轉(zhuǎn)接之前和轉(zhuǎn)接4周后的增殖效果。由圖可知，轉(zhuǎn)接后芽顯著增大、增多，增殖系數(shù)高達(dá)30，表明該培養(yǎng)基配方適合小鱗莖增殖。

E、F分別為郁金香鱗片轉(zhuǎn)接前(7月31)和轉(zhuǎn)接4周后(8月27)。圖3 小鱗莖增殖和生長(zhǎng)情況

圖4是7月31日內(nèi)層鱗片在MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)誘導(dǎo)得到的小鱗莖，并于10月10日、12月11日、1月20日在MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)接，小鱗莖顏色濃綠、健壯、數(shù)量增多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，表明該配方適合小鱗莖生長(zhǎng)。

A、B、C分別為12月20日、1月22日和2月27日拍攝。圖4 小鱗莖生長(zhǎng)情況

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，選用75%酒精2 min+2% NaClO 20 min對(duì)郁金香鱗片進(jìn)行消毒的效果最佳，鱗片污染率為15%。郁金香組培研究[10-13]多選用0.1%HgCl2對(duì)外植體進(jìn)行消毒，本文選用低毒的NaClO進(jìn)行嘗試，且消毒效果較好，這為今后郁金香組培提供了一定技術(shù)參考。

本研究中不同層的鱗片誘導(dǎo)效果差異顯著。隨著由外向內(nèi)進(jìn)行鱗片接種，其愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸減小，而小鱗莖誘導(dǎo)率逐漸增大，這與胡新穎等[11]的研究結(jié)果趨勢(shì)相同，但誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于其試驗(yàn)結(jié)果。胡新穎等[11]研究表明，中層鱗片易誘導(dǎo)成愈傷組織，誘導(dǎo)率為8.0%；內(nèi)層鱗片較易直接誘導(dǎo)生芽，再生率達(dá)26.7%。本研究中，外層鱗片愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)88.00%，內(nèi)層小鱗莖誘導(dǎo)率高達(dá)57.89%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本研究中鱗莖取材時(shí)間是3月，此時(shí)正處于更新球膨大期，而胡新穎等[11]選自荷蘭進(jìn)口種球，此期一般已完成花芽分化，這可能是二者誘導(dǎo)率不同的主要原因。因此，不同取材時(shí)期等因素對(duì)郁金香組織培養(yǎng)的影響也是接下來(lái)的研究重點(diǎn)。

本文中兩個(gè)不同時(shí)期取材得到的誘導(dǎo)效果有顯著差異。2019年3月27日田間郁金香處于更新球膨大期，該階段取材的更新球外面仍包著一層老鱗片，但老鱗片干皺不飽滿。2019年7月31日外植體取自收獲后的種球，這一時(shí)期郁金香鱗莖內(nèi)的花芽分化已經(jīng)完成。鱗莖膨大期的鱗片可直接誘導(dǎo)出愈傷組織和小鱗莖，花芽分花后期的鱗片可誘導(dǎo)出小鱗莖和綠葉組織，說(shuō)明鱗莖的取材時(shí)間和發(fā)育狀態(tài)對(duì)小鱗莖的誘導(dǎo)結(jié)果不同。由此可見，外植體取材部位和取材時(shí)期的選擇可能是影響誘導(dǎo)出愈傷組織還是直接誘導(dǎo)小鱗莖的關(guān)鍵因素。

本試驗(yàn)中選用帶有底盤的不同層鱗片作為外植體，內(nèi)層鱗片的基部可直接誘導(dǎo)出小鱗莖，誘導(dǎo)率高達(dá)73.33%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，有的鱗片可直接誘導(dǎo)出小鱗莖，而部分鱗片則同時(shí)誘導(dǎo)出小鱗莖和綠色葉片，該現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中未見報(bào)道。小鱗莖在6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基上顏色濃綠、生長(zhǎng)健壯、數(shù)量增多，說(shuō)明該配方比較適合小鱗莖的增殖。

對(duì)鱗片直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的組織的稱呼多有不同，有稱為再生小鱗莖[10，13]、再生芽[11]或不定芽[12]。本文中發(fā)現(xiàn)由鱗片直接誘導(dǎo)出的該組織由底部膨大發(fā)白的鱗片和上部伸長(zhǎng)呈綠色管狀的芽組成，該結(jié)構(gòu)與郁金香鱗莖基部外側(cè)長(zhǎng)出來(lái)的小鱗莖極為相似，因此，本文稱其為小鱗莖。