黃明翔，陳新朝，陳曉紅，方美蘭

據(jù)世衛(wèi)組織報告，結(jié)核病仍是危害人類健康的重大疾病，是全球十大死亡原因之一。我國是結(jié)核病高負擔國家，結(jié)核病病例居世界第2位，防治形勢嚴峻[1]。結(jié)核病的早期診斷對及時治療患者，控制其傳播具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)涂片顯微鏡檢查陽性率低且不能區(qū)分陽性菌是結(jié)核還是非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosisMycobacterium，NTM)，而培養(yǎng)需要3～8周的時間不能滿足快速診斷的要求。近年來，興起的分子生物學方法具有快速、敏感性高等特點，多種分子生物學檢測技術已應用于結(jié)核病診斷，并成為結(jié)核病診斷標準之一[2]。

本研究使用的PCR熒光探針檢測試劑盒是針對MTB的DNA J基因設計2條特異性引物，通過KOD DNA聚合酶采用熒光探針Q Probe對樣本中的結(jié)核分枝桿菌相應的核酸片段進行擴增檢測。DNA J基因是Hsp40(熱休克蛋白)的成員之一，控制熱休克σ因子32，已用于包括軍團菌、葡萄球菌、鏈球菌等多種細菌研究[3]。KOD DNA聚合酶來源于超嗜熱古菌(ThermococcusKodakaraensis)，與臨床常用PCR反應體系的Taq DNA聚合酶比較，它的合成速度是Taq DNA聚合酶的2.5倍[4]，因此具有很高的檢測效率。但因為KOD DNA聚合酶具有很高的DNA延長能力以及過強的3′-5′核苷酸外切酶活性，所以其在PCR中很難控制，國內(nèi)有少部分高?？蒲性核谑褂肒OD DNA聚合酶開發(fā)產(chǎn)品，但截至目前為止，國內(nèi)外還沒有相關技術在結(jié)核病診斷應用的報道。本研究旨在通過應用該方法檢測臨床結(jié)核病疑似患者痰樣本，以臨床診斷為參照，MGIT960液體培養(yǎng)法為金標準，基于Taq DNA聚合酶熒光PCR為對照方法，探討KOD DNA聚合酶熒光PCR在結(jié)核病快速診斷的應用價值。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2019年10月至2020年4月在我院結(jié)核科住院的具有肺結(jié)核癥狀、體征的疑似肺結(jié)核病患者作為研究對象，收集患者痰標本進行涂片抗酸染色、MGIT960液體培養(yǎng)、KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測及Taq DNA聚合酶熒光PCR檢測。

1.2臨床診斷及隨訪 臨床醫(yī)生根據(jù)患者的痰涂片結(jié)果、影像學診斷結(jié)果(胸片或CT)和臨床檢查結(jié)果對患者進行初步診斷，對于確診肺結(jié)核患者進行抗結(jié)核治療。2個月后對KOD DNA聚合酶的熒光PCR檢測陰性排除肺結(jié)核患者進行隨訪，以確認最終診斷結(jié)果。

1.3主要儀器與試劑 BACTEC MGIT960液體培養(yǎng)儀及配套試劑，美國BD公司；TCG-D1全自動核酸提純及定量熒光PCR分析系統(tǒng)，日本東洋紡株式會社；ABI7500全自動實時熒光定量PCR儀，美國Life Technologies Holdings Pte Ltd?？顾崛旧嘿徸灾楹Ｘ愃魃锛夹g有限公司；商品化配套試劑盒包括：聚合酶試劑[KOD Mix]、引物MTB F：5′-ACGGCGCTGAGTTCAACCTCAACG-3′、反向引物MTB R：5′-GAACAAGCCACCGAACAAGTCACCGAT-3′、Q探針: 5′-CGAACCGGCGGTACCAC-3′，以上試劑購自日本東洋紡株式會社； Taq DNA聚合酶熒光PCR法選用中山大學達安基因試劑。

1.4 研究方法

1.4.1倫理情況 本試驗通過福州結(jié)核病防治院倫理委員會批準(批件號：2018-008(科研)-01)。

1.4.2臨床診斷 肺結(jié)核診斷標準參考《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[5]，以患者的出院診斷作為臨床診斷結(jié)果。

1.4.3痰涂片抗酸染色檢查 按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]。

1.4.4MGIT960液體培養(yǎng)法 嚴格按照BACTEC MGIT960系統(tǒng)操作說明書進行培養(yǎng)，吸取約5 mL(不超過10 mL)痰液加入帶有螺旋帽的50 mL離心管中，加入與標本等量的NaOH-NALC前處理液，振蕩消化15 min，加入40 mL pH6.8磷酸緩沖液(PBS)，3 000 g離心15 min，棄上清，加入1～2 mL PBS(pH6.8)，以制備成懸濁液，0.5 mL接種至準備好的MGIT培養(yǎng)管進行液體培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果由儀器自動報告陽性后，進行抗酸涂片和菌種鑒定。

1.4.5菌種鑒定方法 應用PNB和TCH生長試驗進行初步菌種鑒定，PNB不生長TCH生長鑒定為MTB，PNB、TCH均生長鑒定為NTM[6]。

1.4.6Taq DNA聚合酶熒光PCR 取1 mL痰液中加入4倍體積的4%氫氧化鈉搖勻，室溫下液化30 min，取0.5 mL至1.5 mL離心管中，再加入0.5 mL 4% 氫氧化鈉搖勻，室溫放置10 min后15 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加1 mL無菌生理鹽水打勻，15 000 r/min 離心5 min，再重復洗滌1次，沉淀直接加50 μL DNA提取液充分混勻，100 ℃水浴10 min，轉(zhuǎn)至4 ℃靜置6～8 h以保證充分裂解，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 μL做PCR反應。陽性判斷：Ct值<30實驗結(jié)果為陽性。

1.4.7KOD DNA聚合酶熒光PCR 取100 μL的樣品與等量溶解吸附液到研磨管進行混合，80 ℃下加熱 10 min進行滅菌，將研磨管置于漩渦振蕩器上振蕩 20 次，加入 800 μL溶解吸附液，13 000 g，離心 3 min，取 170 μL上清液到試劑分裝盒，封上鋁箔紙， 放置試劑分裝盒到儀器里，按全自動分析系統(tǒng)操作說明書操作。熔解曲線熒光峰值大于≥10。

1.4.8PCR擴增條件設置 見表1。

表1 兩種方法PCR擴增條件

1.5采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析 用kappa檢驗驗證2種方法檢測結(jié)果的一致性。Kappa≥0.75表示二者一致性較好；95%CI均采用“正態(tài)近似法”進行計算；兩種方法結(jié)果差異統(tǒng)計學分析采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1病例入選及診斷類型 共收集344例，其中肺結(jié)核疑似患者237例，排除12例出院診斷不明確及7例經(jīng)培養(yǎng)鑒定為非結(jié)核分枝桿菌感染患者，納入最后結(jié)果分析的臨床診斷結(jié)核病有效病例為218例，非肺結(jié)核患者107例。

2.2入選病例基本情況 入選病例中臨床診斷為肺結(jié)核患者218例，非肺結(jié)核患者107例。其中，男性236例(72.6%)，女性89例(27.4%)；<20歲患者20例(6.2%)，≥20歲65例(20.0%)，40～歲119例(36.6%)，60～歲121例(37.2%)。具體情況見表2。

表2 納入樣本人群信息

2.3抗酸桿菌涂片結(jié)果 218例肺結(jié)核患者中涂片陽性84例(38.53%)，涂片陰性134例(61.47%)。

2.4兩種不同DNA聚合酶熒光PCR結(jié)果比較 在納入統(tǒng)計有效樣本325例中，KOD DNA聚合酶法和Taq DNA聚合酶法陽性符合率為92.94% (95%CI：89.09%～96.79%)，陰性符合率為94.19% (95%CI：90.51%～97.88%)，總符合率 93.54% (95%CI：90.87%～96.21%)。兩種檢測方法比較，Kappa=0.871>0.75，檢測結(jié)果有較好的一致性，見表3。

表3 兩種熒光PCR結(jié)果比較

2.5KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測結(jié)核分枝桿菌效能

2.5.1以臨床診斷結(jié)果為標準，評價KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測效能，并與結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)、Taq DNA聚合酶熒光PCR進行比較 在臨床診斷的肺結(jié)核患者中，MGIT960液體培養(yǎng)、Taq DNA聚合酶熒光PCR、KOD DNA聚合酶熒光PCR的敏感度分別為71.56%、76.15%、76.61%，KOD DNA聚合酶熒光PCR與MGIT960液體培養(yǎng)檢測敏感度差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.445，P=0.229>0.05)，見表4。

表4 與臨床診斷結(jié)果比較，MGIT960培養(yǎng)及兩種熒光PCR檢測結(jié)核分枝桿菌效能

2.5.2以液體培養(yǎng)試驗結(jié)果為標準評價KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測結(jié)核分枝桿菌效能 收集的344份痰樣本中有7例培養(yǎng)陽性，菌種經(jīng)PNB法鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，兩種PCR熒光探針法檢測均為陰性。為便于討論將這7例排除，另有12例診斷不明也被排除，共325例病例納入統(tǒng)計分析。以MGIT960液體培養(yǎng)為標準，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測MTB敏感度為92.31%(144/156)和特異度為86.39% (146/169)；在237例涂片陰性患者中，敏感度和特異度分別為 84.21%(64/76)和88.48%(146/165)，見表5。

表5 與MGIT960液體培養(yǎng)比較，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測結(jié)核分枝桿菌效能

2.5.3兩種熒光PCR與細菌學方法檢測肺結(jié)核病例結(jié)果比較 在涂陽、培養(yǎng)陽性、及任一種細菌學方法陽性肺結(jié)核患者中，KOD DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為100%、92.31%、92.50%，Taq DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為100%、89.74%、90.00%，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.628、0.626,均P>0.05)；在涂陰、培養(yǎng)陰性、及兩種細菌學方法均為陰性肺結(jié)核患者中，KOD DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為61.90%、37.10%、32.76%，Taq DNA聚合酶熒光PCR法敏感度為61.10%、41.94%、37.93%，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.16、0.304、0.340,均P>0.05)，見表6。

3 討 論

結(jié)核病的早期診斷對于病人獲得及時治療和疫情的防控具有十分重要的意義。近年來興起的分子生物學檢測技術具有快速、靈敏度高等優(yōu)點，已逐漸成為我國結(jié)核菌實驗室常規(guī)檢測項目，并作為肺結(jié)核診斷依據(jù)之一[5]。PCR熒光探針法是目前國內(nèi)結(jié)核菌實驗室使用最為廣泛的分子生物學方法之一，而其中又以TaqMan熒光探針法最為常見[7]。該方法檢測快速、靈敏，但也存在易污染、操作復雜、對人員和實驗室環(huán)境要求高等缺點。

本研究應用的PCR 熒光探針法采用的是 KOD DNA聚合酶，該酶具有熱穩(wěn)定性好、DNA合成速度快、合成錯誤率低的特點，與Tag DNA聚合酶比較，該酶在95 ℃可穩(wěn)定12 h，而Tag DNA聚合酶只能穩(wěn)定1.6 h；在DNA合成速率和錯誤率方面，KOD DNA聚合酶為100 bp/s，錯誤率僅為0.1%，Tag DNA聚合酶為54 bp/s，錯誤率為4.8%，采用KOD DNA聚合酶，可以使1次循環(huán)的時間從原來的幾分鐘縮短為幾十秒[8-9]。本研究中PCR使用QProbe為探針，QProbe通過混合特定的排列，將具有熒光消失這一特征的熒光色素作為標識的探針。利用這一特征，就無需使用插入DNA嵌入劑等其它雙鏈核酸結(jié)構(gòu)的色素，也無需使用會引起FRET現(xiàn)象的2種探針，而是使用在一種熒光物質(zhì)中作出標識的探針，在不會阻礙高速擴增的同時，能夠特異性地檢測出目標核酸排列[10]。另外，本研究PCR擴增的目標基因為DNA J基因。目前國內(nèi)外研究較多的目標基因主要有插入序列IS6110(inSertion sequence 6110，IS6110)、16S核糖體RNA基因(16s ribosomal RNA，16srRNA)等。有研究發(fā)現(xiàn)亞洲地區(qū)流行的部分MTB菌株中，IS6110拷貝數(shù)較少或無此插入序列[11]，這可能導致檢測陽性率降低；另有研究發(fā)現(xiàn)一些NTM菌種存在與IS6110具有同源性的基因片段，如龜分枝桿菌(M.chelonae)[12]，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。16SrRNA基因在多達100余種的分枝桿菌屬(Mycobacterium)中也存在交叉反應，也會導致檢測的假陽性結(jié)果。DNA J基因菌種特異性高，國外研究表明應用該基因檢測MTB不會與不同種類分枝桿菌產(chǎn)生交差反應，具有較好的靈敏度和特異度[4]。

本研究同時使用MGIT960液體培養(yǎng)法、Taq DNA聚合酶熒光PCR和KOD DNA聚合酶熒光PCR熒光探針法3種方法檢測肺結(jié)核疑似患者的痰樣本，結(jié)果顯示兩種熒光PCR檢測結(jié)果具有較好的一致性(Kappa=0.871>0.75)。由表3結(jié)果可見，以臨床診斷結(jié)果為標準，3種檢測方法的Kappa值在0.624～0.683之間，均接近較好水平，而其中KOD DNA聚合酶熒光PCR的一致性最好。在檢測敏感度方面，KOD DNA聚合酶熒光PCR達到76.61%，與國外文獻報道的熒光PCR70.4% 的檢測敏感度相近[13]，研究結(jié)果顯示本法敏感度遠高于涂片鏡檢(38.53%)，與液體培養(yǎng)法無差別(P=0.229>0.05)，雖然理論上PCR的敏感度應高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，但國內(nèi)外均有PCR法敏感度與培養(yǎng)法無差別的報道[14-15]，這可能與PCR試劑設計的檢測敏感度及痰中存在PCR抑制因子在結(jié)核菌量低時影響檢出率有關[16]；在特異度方面KOD DNA聚合酶熒光PCR達到100%，未納入統(tǒng)計的7例NTM標本，檢測結(jié)果也均為陰性，顯示該方法選用的目標基因DNA J基因具有較好的種屬特異性。表5結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)試驗結(jié)果為金標準，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測敏感度和特異度分別為92.31%和86.39%，特別在涂陰患者中敏感度達到84.21%，略高于Hida等[17]人報道的敏感度(72.7%)。另外，本研究顯示在涂片陰性、培養(yǎng)陰性和雙陰性肺結(jié)核患者中，KOD DNA聚合酶熒光PCR的陽性率分別達到了61.90%、37.10%、32.76%，該結(jié)果表明KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測MTB 的高靈敏度極大提高了肺結(jié)核尤其是菌陰肺結(jié)核的檢出率，為結(jié)核病的早期診斷提供實驗室依據(jù)。

本研究方法配套使用的PCR分析系統(tǒng)具有全自動核酸提取及定量熒光PCR分析的功能，且系統(tǒng)為全封閉式。與傳統(tǒng)熒光定量PCR法相比，該方法全過程僅需60 min大大縮短了檢測時間，相較于世衛(wèi)組織推薦的Genexpert系統(tǒng)也快了近1倍[18]。

本方法操作簡便，標本僅需NALC-NaOH處理后即可上機，對實驗人員操作熟練度要求低，同時全封閉系統(tǒng)極大降低了生物安全和實驗污染風險，不需要對實驗區(qū)域進行分區(qū)。但本法尚不能檢測耐藥基因，是今后需要改進的地方。綜上，KOD DNA聚合酶熒光PCR檢測MTB具有敏感度高、特異度高、操作簡便、快速等優(yōu)點，適合各級結(jié)核病實驗室開展。

利益沖突：無