(河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

我國(guó)土壤重金屬污染現(xiàn)象十分嚴(yán)重，是目前危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康的主要環(huán)境問(wèn)題之一。近年來(lái)，隨著工業(yè)化發(fā)展、城市化規(guī)模擴(kuò)張以及農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)對(duì)土壤的影響，全國(guó)范圍內(nèi)的汞污染土壤問(wèn)題十分嚴(yán)峻，已經(jīng)對(duì)水環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1,2]。土壤中的汞會(huì)通過(guò)生物富集進(jìn)入農(nóng)產(chǎn)品，再經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，威脅人類健康，同時(shí)引發(fā)環(huán)境問(wèn)題[3,4]。因此，作物抗逆性育種研究的一個(gè)重要方向就是選擇低累積、耐重金屬的作物新材料種植于受污染的土地。

重金屬汞對(duì)高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育有嚴(yán)重影響。鄒繼穎等[5]、蔣家煥等[6]對(duì)水稻進(jìn)行研究表明，隨著營(yíng)養(yǎng)液中汞施入量的逐漸增加，水稻根、莖、葉對(duì)汞的吸收也增加，生育期較短的水稻材料吸收效率最明顯。在大豆中的研究表明，隨著土壤外源汞濃度的增加，大豆的出苗率、根系生長(zhǎng)速率受到不同程度的抑制，導(dǎo)致幼苗生長(zhǎng)速率減緩[7]。陳禮洪等研究發(fā)現(xiàn)，汞污染在低濃度時(shí)可促進(jìn)油菜生長(zhǎng)，汞濃度超過(guò)1.0 mg·kg-1時(shí)，就顯著抑制油菜生長(zhǎng)，引起葉片變小、失綠變黃甚至枯萎等現(xiàn)象[8]。汞污染也嚴(yán)重危害水生植物的生長(zhǎng)發(fā)育，低濃度的汞污染可導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)活性的增強(qiáng)，而高濃度的汞污染會(huì)對(duì)水生植物造成不可逆轉(zhuǎn)的影響[9]。計(jì)汪棟等研究了菹草對(duì)Hg2+脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，重金屬毒害植物的一個(gè)重要特征就是引起葉綠素減少、蛋白質(zhì)含量降低，從而使植物失綠，產(chǎn)生毒害現(xiàn)象[10]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)汞對(duì)植物的污染可損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，最終破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定[11]。

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是對(duì)重金屬等非生物逆境脅迫耐性較強(qiáng)的作物之一[12]。雖然重金屬脅迫對(duì)棉花的生長(zhǎng)發(fā)育造成不利影響，但因棉花自身具有較完整的應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)保護(hù)機(jī)制，且棉花主產(chǎn)品非食用的特點(diǎn)，可作為重金屬污染土壤中的一種修復(fù)作物[13]。本研究選擇6個(gè)不同棉花材料進(jìn)行汞污染處理，測(cè)定HgCl2脅迫對(duì)棉花發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)，并對(duì)幼苗葉綠素含量、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、過(guò)氧化物酶的活性和根系活力進(jìn)行分析，以期為抗汞棉花品種的選育和污染土壤上棉花種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以6個(gè)不同類型的棉花品種作為供試材料：中S 9612(敏旱、敏鹽)、中H 117(耐旱)、中9835(耐鹽)、中棉所50、百棉15和早鈴1號(hào)。

1.2 設(shè)計(jì)與處理

挑選大小均勻、籽粒飽滿的棉花種子，用2%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，再用滅菌的蒸餾水浸種24 h，以鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿作為發(fā)芽床進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)。采用0.5 mmol·L-1的HgCl2溶液對(duì)棉花種子進(jìn)行萌發(fā)期脅迫處理，蒸餾水作對(duì)照，將種子排列在鋪有2層浸濕不同濃度處理液濾紙的培養(yǎng)皿中，以種子和濾紙濕潤(rùn)為宜。每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)，放入溫度28 ℃、光/暗周期為14 h/10 h的人工氣候箱中培養(yǎng)。每天觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)。另取試驗(yàn)材料播種于處理和對(duì)照的營(yíng)養(yǎng)土中，待棉花長(zhǎng)出3 片真葉時(shí)開(kāi)始起苗取樣，每次每個(gè)處理取樣3～5片葉，用蒸餾水沖洗干凈后，吸水紙吸干，剪碎，稱取棉花葉片，每份0.3 g 左右，編號(hào)包裝，用液氮速凍后，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

取處理樣品測(cè)定各生理指標(biāo)，用丙酮浸提法測(cè)定葉片的葉綠素含量，用茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸含量，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量，比色法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD) 活性，愈創(chuàng)木酚氧化法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性，將根尖樣品采用TTC法測(cè)定其根系活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SAS軟件分析6個(gè)材料在HgCl2處理和對(duì)照中的差異顯著性，并用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 汞脅迫對(duì)不同材料棉花種子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，6個(gè)棉花材料的種子以中50發(fā)芽勢(shì)最高，其次是中H 117和中S 9612，經(jīng)過(guò)HgCl2脅迫處理后，中S 9612的發(fā)芽勢(shì)下降幅度最小，其余5個(gè)材料的發(fā)芽勢(shì)都低于20%,可以看出，6個(gè)棉花材料的種子中的中S 9612發(fā)芽勢(shì)所受影響最小，中50所受處理影響最大；6個(gè)棉花種子發(fā)芽率都高于80%，而在脅迫后中S 9612的發(fā)芽率下降幅度最小，其次是中H 117和中9835，而百棉15發(fā)芽率下降幅度最大，發(fā)芽率降至20%，說(shuō)明該材料棉花種子在汞處理后大部分種子沒(méi)有發(fā)芽，很可能是脅迫處理導(dǎo)致種子死亡而引起的。

2.2 汞脅迫對(duì)棉花幼苗生長(zhǎng)的影響

脅迫下葉綠素含量的變化，在一定程度上可以反映植物抵抗外界脅迫的能力。理論上，一定的脅迫可使植物做出抵觸反應(yīng)，體內(nèi)葉綠素a和葉綠素b含量會(huì)短時(shí)間內(nèi)升高，而過(guò)多的脅迫則使植物體內(nèi)葉綠素含量降低。6個(gè)棉花材料在對(duì)照組中，中9835的葉綠素a含量最高，其次是早鈴1號(hào)和中H 117。處理后，中S 9612、中H 117和早鈴1號(hào)的葉綠素a和葉綠素b的含量與對(duì)照相比均升高，中50和百棉15葉綠素a含量比對(duì)照含量低。

在植物遇到外界脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)積累大量的游離脯氨酸。在植物體內(nèi)大量的、高濃度的游離脯氨酸可以幫助植物抵抗外界脅迫，通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定游離脯氨酸含量的變化來(lái)判斷脅迫對(duì)棉花幼苗的影響。由圖3可知，處理前百棉15體內(nèi)游離脯氨酸的含量最高，其次是中S 9612和中50。處理后，中S 9612、中9835、中50和早鈴1號(hào)的游離脯氨酸含量比對(duì)照都低，而中H 117和早鈴1號(hào)比對(duì)照高。分析結(jié)果可得，中H 117和早鈴1號(hào)對(duì)0.5 mmol·L-1的HgCl2有抵觸脅迫作用，而另外4種材料則因脅迫處理濃度過(guò)大使脯氨酸含量下降。

圖3 HgCl2脅迫下6種棉花材料的游離脯氨酸含量

2.3 汞脅迫對(duì)棉花可溶性蛋白和POD活性的影響

植物在逆境條件下可通過(guò)提高可溶性蛋白的合成速率，增加其含量來(lái)直接參與適應(yīng)逆境脅迫，高含量的可溶性蛋白可使細(xì)胞維持較低的滲透勢(shì)，抵抗脅迫帶來(lái)的傷害。由圖4可知，在所有處理組中可溶性蛋白含量最高的是中50，其次是百棉15和中S 9612。處理后，中S 9612、中H 117、中9835和早鈴1號(hào)的可溶性蛋白含量都比對(duì)照高，中50和百棉15比對(duì)照低。

SOD能催化生物體內(nèi)超氧自由基歧化反應(yīng)的產(chǎn)生，可有效清除氧自由基，并防止氧自由基破環(huán)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能。對(duì)照組中，中9835的超氧化物歧化酶活性最高，由圖5可知，在所有處理中，中9835的超氧化物歧化酶活性也是最高，中S 9612、中50和早鈴1號(hào)均比對(duì)照活性低，其他2個(gè)材料無(wú)明顯變化。

POD是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，它們能催化很多反應(yīng)。POD是以過(guò)氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，普遍意義上來(lái)講，POD可以催化消除植物體內(nèi)不利因子的反應(yīng)。棉花組織內(nèi)含有大量的POD，它與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中生理生化變化有著緊密的聯(lián)系。對(duì)照組中，中S 9612的POD活性最高，其次是中H 117和百棉15。由圖6可知，中H 117的活性比對(duì)照低，其他材料中的POD活性均比對(duì)照高，其中早鈴1號(hào)的POD活性增加幅度最大，其次是中50和中9835。

圖4 HgCl2脅迫下6種棉花材料的可溶性蛋白含量

圖5 HgCl2脅迫下6種棉花材料的SOD活性

圖6 HgCl2脅迫下6種棉花材料的POD活性

2.4 汞脅迫對(duì)棉花根系活力的影響

根系是植物維持生存的基礎(chǔ)，它可以吸收水分、養(yǎng)分、礦物營(yíng)養(yǎng)和合成有機(jī)物。由圖7可知，中9835的根系活力TTC還原強(qiáng)度最強(qiáng)，其次是中H 117和中50。處理過(guò)后，所有材料的根系活力TTC還原強(qiáng)度與對(duì)照相比都在下降，下降最小的棉花材料是中9835，而中9835的TTC還原強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其它5個(gè)材料。

圖7 HgCl2脅迫下6種棉花材料的根系活力

3 結(jié)論與討論

植物在受到脅迫后會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的防御機(jī)制，以降低環(huán)境變化對(duì)自身的損害[14,15]。本研究對(duì)6個(gè)棉花材料進(jìn)行0.5 mmol·L-1的HgCl2處理，從發(fā)芽率、生理特性、保護(hù)酶系統(tǒng)和根系活力等方面探討了棉花在重金屬汞脅迫下的耐受力。

本試驗(yàn)選取的高濃度HgCl2溶液對(duì)6種材料的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均有所影響，表現(xiàn)為發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率大幅度下降，其中中S 9612的發(fā)芽率下降幅度最小，其次是中H 117和中9835。研究表明，高濃度的銅、鉛、鉻等重金屬處理植物種子時(shí)對(duì)其發(fā)芽率有明顯抑制作用[16-18]。而高濃度Hg2+溶液處理小麥和蔬菜作物后，葉綠素含量會(huì)明顯下降，嚴(yán)重者葉片畸形、脫落，莖基部腐爛，植株瀕于死亡[19,20]。本試驗(yàn)在較高濃度的汞處理后，中50和百棉15兩個(gè)棉花材料的幼苗體內(nèi)的葉綠素含量降低，隨著毒害時(shí)間延長(zhǎng)，葉片發(fā)生干枯甚至脫落，其余4個(gè)材料的葉綠素含量升高，可見(jiàn)對(duì)這4個(gè)材料而言，該處理濃度尚不能對(duì)植物造成脅迫危害。植物受到外界脅迫時(shí)體內(nèi)也會(huì)積累大量的游離脯氨酸，而且會(huì)提高植物體內(nèi)可溶性蛋白的合成速率，可溶性蛋白可直接參與并應(yīng)對(duì)逆境脅迫[21,22]。本試驗(yàn)中，中H 117和早鈴1號(hào)的游離脯氨酸含量與對(duì)照相比較明顯增多，中H 117、中9835、中S 9612和早鈴1號(hào)的可溶性蛋白的含量與對(duì)照相比較明顯升高，從這幾個(gè)生理指標(biāo)的研究可發(fā)現(xiàn)，中H 117和早鈴1號(hào)的表現(xiàn)較好。

重金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧化脅迫可通過(guò)高效的酶促系統(tǒng)進(jìn)行清除，植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與保護(hù)酶系統(tǒng) SOD、POD 及過(guò)氧化氫酶(CAT)等有效清除氧自由基，防止氧自由基破環(huán)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能，維持氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡，從而緩解氧化傷害增加抗逆性[23-25]。6個(gè)棉花材料中，中H 117和中9835的SOD酶和POD酶含量均增加，說(shuō)明該濃度汞脅迫使植物葉片細(xì)胞膜受到破壞，致使胞內(nèi)物質(zhì)流失嚴(yán)重，耐鹽、耐旱材料在重金屬脅迫下的耐受力強(qiáng)于其它材料。土壤重金屬向植物根部遷移是植物吸收累積重金屬的重要一步[26]，根系活力的高低直接反映出植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況以及作物產(chǎn)量，汞脅迫后植物的根系也能表現(xiàn)出該植物對(duì)重金屬汞的逆境脅迫處理的機(jī)體反應(yīng)。不同材料之間因品種不同而表現(xiàn)出根系活力不同程度的下降，中9835的根系活力受影響最小，說(shuō)明該材料植物根系依然能從土壤中獲取足夠的養(yǎng)分來(lái)抵抗脅迫。

綜上所述，從發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率來(lái)衡量6個(gè)材料的抗逆性，中S 9612的表現(xiàn)最好；從棉花幼苗生理生化指標(biāo)的測(cè)定和保護(hù)酶系統(tǒng)以及根系活力來(lái)判斷，可以得出6個(gè)棉花材料中的中H 117和中9835表現(xiàn)優(yōu)良，可以抵抗一定的重金屬汞污染，適宜在重金屬污染的土地上種植幼苗。