曾 磊，王美燕，付學峰

0 引言

皮膚鱗狀細胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)是我國最常見的皮膚惡性腫瘤之一，起源于表層皮膚或皮膚附屬器角質形成細胞，多發(fā)于面部、耳部、手背等見光部位[1-2]。cSCC發(fā)病機制較為復雜，是多種因素逐步影響、綜合作用的結果，暫無有效治療措施。因此,研究cSCC發(fā)病的分子機制，尋求有效并可靠的靶向治療目標，是當前cSCC基因治療的熱點[3]。研究表明，與正常皮膚細胞相比，cSCC細胞中的基因轉錄水平和模式均存在差異，而細胞內的非編碼RNA在基因表達調控、細胞發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調控功能的非編碼RNA，存在于多種生物基因組中，參與細胞生長、增殖、分化、凋亡等多種過程[5]。miR-21可看作一種致癌基因，在多種腫瘤組織中表達異常，調控腫瘤發(fā)生發(fā)展、演變進程等，近年研究發(fā)現(xiàn)，在cSCC中同樣存在miR-21的異常表達[6-7]。程序性細胞死亡因子4(Programmed cell death 4,PDCD4)是一種抑癌基因，在人腦、肝、肺、胃、皮膚等多種組織中均有表達，而在結直腸癌、卵巢癌、胃癌等多種腫瘤組織中則存在PDCD4的低表達甚至缺失，且與腫瘤的演變進程、惡性程度和預后生存密切相關[8-9]。在cSCC中PDCD4表達下降，但其對cSCC細胞增殖、侵襲、凋亡等生物學行為中的影響尚無定論[10]。本研究通過探討miR-21和PDCD4對cSCC細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學行為的影響，以期為cSCC的診療提供有效的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 人正常皮膚細胞HaCaT及人皮膚鱗狀細胞癌細胞A431、HSC-5、SCL-1 購于上海生命科學研究所；逆轉錄PCR試劑盒、Trizol試劑盒、蛋白提取試劑盒均購于德國QIAGEN公司；Lipofectamine TM 2000轉染試劑、熒光素酶試劑盒均購于美國vector公司；MTT試劑盒、Transwell試劑盒、Western blot試劑盒購自美國BD公司；miR模擬物(miR-21 mimic)及陰性對照(miR-NC)、miR抑制劑(miR-21 inhibitor)及陰性對照(miR-NC)、PDCD4過表達載體(OE-PDCD4)及陰性對照(OE-NC)、PDCD4干擾載體(si-PDCD4)及陰性對照(si-NC)、miR-21和U6引物均購于上海吉瑪有限公司；野生型(WT)和突變型(MUT)PDCD4質粒由上海生工生物公司合成；PDCD4抗體及相應二抗均購于美國Sigma公司。

1.2 研究方法 細胞培養(yǎng)：取出凍存在液氮罐中的HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1細胞株，37 ℃水浴解凍，以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、95%濕度、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，定期換液。

1.2.1 PCR檢測miR-21的表達 取對數(shù)生長期HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1細胞，Trizol法提取細胞總RNA，按照逆轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒說明書，以相應的反轉錄引物進行逆轉錄反應，條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min，最后80 ℃ 5 min。采用實時定量PCR進行擴增，95 ℃ 5 min預變性，然后90 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min，共進行40個循環(huán)。實驗操作嚴格按照相應試劑盒說明書進行，miR-21和U6引物見表1。miR-21的表達水平采用等式2-△△CT法分析，△△CT=△CT實驗組-△CT對照組；△CT實驗組=CT目標基因，實驗組-CT內參基因，實驗組；△CT對照組=CT目標基因，對照組-CT內參基因，對照組；2-△△CT表示觀察組相對于對照組miR-21的表達倍數(shù)。

表1 miR-21和U6 PCR引物序列

1.2.2 細胞轉染 取對數(shù)期A431細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，將細胞分為空載體對照組(Control)、miR-21抑制劑組(miR-21 inhibitor)和陰性對照組(miR-NC)。待細胞生長至融合度達80%以上時，轉染按照Lipofectamine TM 2000操作說明將空載體、miR-21 inhibitor、miR-NC、OE-PDCD4、OE-NC、si-PDCD4、si-NC分別轉染至A431、SCL-1細胞中，37℃、95%濕度、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot檢測PDCD4表達 收集各組細胞，按照總蛋白提取試劑盒說明書操作提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質量。取蛋白樣品進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗PDCD4(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，暗室顯影，采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.2.4 MTT實驗 細胞轉染24 h后接種于96孔板，調整細胞濃度為5×103個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h時加入20 μl(5 mg/mL)MTT溶液，孵育3 h，棄上清，添加150 μl DMSO。微孔板分光光度計檢測490 nm處的吸光度。

1.2.5 細胞劃痕實驗 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，調整細胞濃度至2×105個/孔，待細胞生長至80～90%融合度時，用移液槍在細胞單層中劃出傷口，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察傷口愈合情況。實驗重復3次。

1.2.6 Transwell小室實驗 實驗前棄去原細胞培養(yǎng)液，更換成無血清培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細胞，取5×105個細胞重懸。取40 μl Matrigel基質膠鋪于Transwell小室，待膠凝固后，取200～250 μl細胞懸液至Transwell小室，下層加入500 μl完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，4%甲醛固定，0.1%結晶紫染液避光染色，清洗晾干后倒置熒光顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞術 轉染后的細胞在1 500 r/min下離心5 min，收集細胞，PBS洗滌。加入5 μl的7AAD和PE標記的Annexin V。流式細胞儀測定細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.8 熒光素酶實驗 構建含有PDCD4 3′UTR結合位點的pGL3-PDCD4-WT野生型熒光素酶報告載體和不含PDCD4 3′UTR結合位點的pGL3-PDCD4-MUT突變型熒光素酶報告載體，將pGL3-PDCD4-WT、pGL3-PDCD4-MUT分別與miR-21 mimics、miR-NC共轉染至A431細胞中，24 h后檢測熒光素酶活性，計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

2 結果

2.1 4種皮膚細胞中miR-21和PDCD4表達比較 通過qRT-PCR檢測各組細胞miR-21表達、Western blot檢測各組細胞PDCD4表達，其中miR-21以U6為內參、PDCD4以GAPDH為內參。結果顯示，與正常皮膚細胞HaCaT相比，A431、HSC-5、SCL-1細胞中miR-21表達均上升，PDCD4表達均下降，以A431、SCL-1細胞變化最為顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。因此，選擇細胞株A431、SCL-1進行后續(xù)試驗。

圖1 4種皮膚細胞中miR-21和PDCD4表達比較注：A.HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1 4種細胞miR-21表達比較；B.HaCaT、A431、HSC-5、SCL-1 4種細胞PDCD4表達比較。*與HaCaT相比，P<0.05

2.2 miR-21和PDCD4靶向關系的預測和驗證 生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-21與PDCD4存在特異性結合位點(見圖2)。熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，PDCD4-WT與miR-21 mimics共轉染A431細胞后，細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而PDCD4-MUT與miR-21 mimics共轉染A431細胞后，細胞熒光素酶活性無變化(P>0.05)，說明PDCD4是miR-21的靶基因(見圖3)。

圖2 miR-21與PDCD4結合位點

圖3 熒光素酶實驗驗證miR-21與PDCD4之間的靶向關系注：與miR-NC相比，*P<0.05

2.3 轉染miR-21 inhibitor后A431細胞中miR-21和PDCD4表達 通過qRT-PCR檢測各組A431和SCL-1細胞中miR-21表達、Western blot檢測各組細胞PDCD4表達，其中miR-21以U6為內參、PDCD4以GAPDH為內參。結果顯示，miR-NC、OE-NC與Control組miR-21、PDCD4表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組miR-21表達下降，PDCD4表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組miR-21表達不變，PDCD4表達增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組A431、SCL-1細胞中miR-21和PDCD4表達情況注：A.各組A431細胞中miR-21表達情況；B.各組A431細胞中PDCD4表達情況；C.各組SCL-1細胞中miR-21表達情況；D.各組SCL-1細胞中PDCD4表達情況。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

2.4 miR-21靶向調控PDCD4表達對A431細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示，A431和SCL-1細胞中，miR-NC、OE-NC與Control組細胞活力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組第24小時、48小時、72小時的細胞活力下降；差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組第24小時、48小時、72小時的細胞活力下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 miR-21靶向調控PDCD4表達對A431、SCL-1細胞增殖的影響注：A.各組A431細胞活力比較；B.各組SCL-1細胞活力比較。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

2.5 miR-21靶向調控PDCD4表達對A431細胞遷移、侵襲的影響 細胞劃痕和Transwell實驗結果顯示，A431和SCL-1細胞中，miR-NC、OE-NC與Control組傷口愈合百分比、侵襲細胞數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組傷口愈合百分比和侵襲細胞數(shù)目均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組傷口愈合百分比和侵襲細胞數(shù)目均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 miR-21靶向調控PDCD4表達對A431、SCL-1細胞遷移、侵襲的影響注：A.細胞劃痕實驗檢測A431、SCL-1細胞中miR-21 inhibitor對細胞遷移能力的影響(400×)B.各組細胞傷口愈合百分比比較；C.Transwell檢測A431、SCL-1細胞中miR-21 inhibitor對細胞侵襲能力的影響(400×)；D.各組細胞侵襲數(shù)目比較。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

2.6 miR-21靶向調控PDCD4表達對A431細胞凋亡的影響 流式細胞術實驗結果顯示，A431和SCL-1細胞中，miR-NC、OE-NC與Control組細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與miR-NC組相比，miR-21 inhibitor組細胞凋亡率上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與OE-NC組相比，OE-PDCD4組細胞凋亡率上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

2.7 干擾PDCD4對A431、SCL-1細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 結果顯示，干擾PDCD4表達后，A431、SCL-1細胞中PDCD4表達下降(圖7A)，24 h、48 h、72 h的OD值均上升，傷口愈合百分比、細胞侵襲數(shù)目均上升，細胞凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖8。

圖7 miR-21靶向調控PDCD4表達對A431、SCL-1細胞凋亡的影響注：A.流式細胞術檢測A431、SCL-1細胞中miR-21 inhibitor對細胞凋亡的影響；B.各組細胞凋亡率比較。*與miR-NC組相比，P<0.05；#與OE-NC組相比，P<0.05

圖8 干擾PDCD4對A431、SCL-1細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響注：A.干擾PDCD4表達后A431、SCL-1細胞中PDCD4表達情況；B.干擾PDCD4后A431、SCL-1細胞增殖變化；C.干擾PDCD4后A431、SCL-1細胞遷移變化(400×)；D.干擾PDCD4后A431、SCL-1細胞侵襲變化(400×)；E.干擾PDCD4后A431、SCL-1細胞凋亡變化。*與si-NC相比，P<0.05

3 討論

cSCC是一種常見的皮膚惡性腫瘤，嚴重影響患者生活質量和預后生存，多發(fā)于老年群體，尤以50～60歲老年患者最為常見。cSCC好發(fā)于皮膚暴露部位，早期表現(xiàn)為浸潤性斑塊，且具有復發(fā)和遠處轉移等特征，但其具體發(fā)病機制尚不清[11-12]。近年來生物學分析發(fā)現(xiàn)，cSCC的發(fā)展是一個多基因、多因素、多階段影響的過程，其發(fā)生發(fā)展機制涉及多種信號通路[13]。因此，從分子生物學角度出發(fā)尋找靶向治療cSCC的標志物，有望為患者提供一種可靠的治療方法。

miRNA是一種約由18～24個核苷酸組成的非編碼RNA，可與其靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)特異性結合位點結合，導致靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯過程，從而實現(xiàn)對基因的靶向調控，影響細胞的增殖、遷移和凋亡等過程[14-15]。目前認為，miRNA在機體中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，參與調控腫瘤的發(fā)生、轉移、浸潤和血管新生等過程[16]。miR-21是一種典型的癌基因，可通過JAK/STAT信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、RaS/MAPK信號通路及PI3K/AKT信號通路等多個細胞信號傳導途徑參與多種實體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，幾乎在所有上皮源性的惡性實體腫瘤中都存在miR-21的高表達[17-18]。抑制或敲除miR-21的表達能夠抑制肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞的生長和遷移，并促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡，對抗腫瘤治療具有重要意義[19]。在本研究中，miR-21在cSCC細胞株中均呈高表達，提示在cSCC中miR-21同樣存在致癌作用。轉染miR-21 inhibitor后，A431細胞在24 h、48 h、72 h時的增殖能力顯著下降，表明抑制miR-21表達后可有效抑制A431細胞的增殖。經細胞劃痕和Transwell實驗，發(fā)現(xiàn)下調miR-21表達后，傷口愈合百分比和細胞侵襲數(shù)目下降，即細胞遷移和侵襲能力受到抑制。流式細胞術檢測A431細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21的表達能增強腫瘤細胞凋亡能力。表明miR-21有可能作為治療cSCC的有效靶標。

PDCD4是一種在進化上高度保守的抑癌基因，正常表達于多種組織和器官中，但在腫瘤細胞中呈低表達甚至不表達[20]。在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PDCD4能夠抑制宮頸癌細胞的惡性行為學活動[21]。對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4在其癌組織中低表達，同時miR-21呈高表達，miR-21的過表達能夠抑制PDCD4，從而參與乳腺癌的發(fā)生[22]。本研究結果中，各cSCC細胞中，PDCD4呈低表達。過表達后，發(fā)現(xiàn)A431、SCL-1細胞增殖、遷移、侵襲能力顯著下降，而細胞凋亡率明顯上升。而干擾PDCD4表達后，A431、SCL-1細胞增殖、遷移、侵襲能力顯著上升，而細胞凋亡率明顯下降。這可能與PDCD4進一步調控其下游信號通路相關。此外，通過生物信息學軟件發(fā)現(xiàn)，miR-21與PDCD4存在特異性結合位點，而熒光素酶實驗進一步證明miR-21可靶向負調控PDCD4表達。

綜上所述，cSCC細胞中均存在miR-21的高表達和PDCD4的低表達，且miR-21能夠靶向負調控PDCD4表達，抑制miR-21表達后，cSCC細胞的增殖、遷移、侵襲能力均下降，細胞凋亡率上升，其作用可能與miR-21表達下降后PDCD4表達上升有關。