劉 偉，張彥忠，白素平，房立真

0 引言

粉防己堿(Tetrandrine，Tet)是從防己科植物粉防己(Stephania tetrandra SMoore)根中提取的一種生物堿，又名漢防己甲素，是粉防己的主要活性成分，其口服或注射劑型在臨床上廣泛用于風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及硅肺等相關(guān)疾病的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，粉防己堿(圖1)具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗多藥耐藥等活性[1]。越來越多的研究顯示，Tet具有較好的抗腫瘤活性[2]，但由于中藥成分的多樣性和作用機(jī)制的多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，Tet的抗腫瘤作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，因此，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對其作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性研究具有重要意義。

圖1 粉防己堿化學(xué)結(jié)構(gòu)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在數(shù)據(jù)庫檢索、高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析和計(jì)算機(jī)模擬等手段基礎(chǔ)上，通過多層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，從而系統(tǒng)地研究藥物、靶點(diǎn)、疾病之間的相互作用，闡明藥物的作用機(jī)制，是一門提高藥物發(fā)現(xiàn)效率的新興學(xué)科[3-4]。因此,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和反向分子對接分析方法，以Tet為研究對象，通過建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，全面系統(tǒng)地預(yù)測和發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)，以闡釋其抗腫瘤作用機(jī)制，為深入揭示Tet的藥理作用提供支持。

1 材料與方法

1.1 反向分子對接及抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 登錄PubChem服務(wù)器，查詢并下載Tet的3D分子結(jié)構(gòu)式，儲存為*.sdf格式。然后將Tet.sdf文件上傳PharmMapper數(shù)據(jù)庫[5]進(jìn)行模擬分子-靶蛋白對接，進(jìn)一步通過UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)的Uniprot ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫以“anticancer或antitumor”為關(guān)鍵詞，收集與抗腫瘤相關(guān)的基因，將挖掘得到的抗腫瘤相關(guān)基因與藥物靶點(diǎn)基因映射篩選出共同基因，從而得到Tet抗腫瘤作用靶點(diǎn)。

1.2 化合物-抗腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選得到的抗腫瘤靶點(diǎn)蛋白在STRING 11.0平臺[6]構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，設(shè)置物種為人、最低相互作用評分>0.4，獲取靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系，再運(yùn)用Cytoscape 3.7.0軟件[7]進(jìn)行繪圖，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，設(shè)置結(jié)點(diǎn)顏色和大小以反映degree的大小，獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3 分子對接驗(yàn)證 根據(jù)其PPI網(wǎng)絡(luò)中拓?fù)鋮?shù)(度數(shù)和接近中心度)進(jìn)行分析，篩選出核心靶點(diǎn)，將其輸入Systems Dock Web Site(Version 2.0)[8]與Tet進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，通過Docking Score評價(jià)Tet與靶點(diǎn)間的結(jié)合活性。

1.4 生物功能與通路富集分析 KOBAS是用于基因/蛋白質(zhì)功能注釋和功能集富集的Web服務(wù)器[9]。將Tet的抗腫瘤靶點(diǎn)基因Gene Symbol轉(zhuǎn)換成ensembl格式的ID，導(dǎo)入KOBAS 3.0分析平臺，獲取靶點(diǎn)的生物學(xué)注釋數(shù)據(jù)，并利用Omicshare平臺將得到的生物過程結(jié)果制作成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 抗腫瘤靶點(diǎn)預(yù)測 Z′-score較Fit Score具有更好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和置信區(qū)間，且Z′-score得分越高說明結(jié)合越好[5]，因此，選取Z′-score>0.5為潛在靶點(diǎn)，從PharmMapper分子-靶蛋白對接結(jié)果中篩選出103個(gè)靶蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫將PBD ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，核對靶蛋白內(nèi)容選擇基因，剔除重復(fù)基因，結(jié)果共得到102個(gè)靶基因。再與Gene Cards數(shù)據(jù)庫挖掘得到5 858個(gè)抗腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行比對，得到86個(gè)Tet抗腫瘤的潛在作用靶點(diǎn)及其在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中的腫瘤相關(guān)性評分，見表1。

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 把篩選得到與Tet相關(guān)的86個(gè)抗腫瘤靶蛋白基因，通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系，并利用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理(圖2)和Network analyzer[10]分析。在圖中，節(jié)點(diǎn)表示蛋白和化合物，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)，其大小反映了靶點(diǎn)蛋白degree的值，節(jié)點(diǎn)越大表示該靶點(diǎn)蛋白的degree值越大，表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，該共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)聚類相關(guān)系數(shù)為0.618，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為83，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)量為11.373，表明Tet抗腫瘤作用具有多靶點(diǎn)屬性，且靶蛋白之間具有強(qiáng)烈的相關(guān)性。

2.3 分子對接分析 根據(jù)上述Network analyzer分析結(jié)果，選擇靶點(diǎn)中每個(gè)靶點(diǎn)的度拓?fù)鋮?shù)值大于中位數(shù)(degree=9)的2倍作為篩選核心靶點(diǎn)的條件[11]，將其Gene Symbol或PDB ID導(dǎo)入Systems Dock Web Site服務(wù)器中，與Tet.sdf格式的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接，進(jìn)一步確認(rèn)這11個(gè)靶點(diǎn)與Tet的結(jié)合活性，見表2。一般認(rèn)為，docking score>7.0表明藥物分子與靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，>5.0表明藥物分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，>4.25表明藥物分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合活性。結(jié)果表明，Tet的11個(gè)核心靶點(diǎn)的docking score>5.0的靶點(diǎn)有8個(gè)，表明Tet與ESR1、NOS3、PPARG、ALB、NR3C1、MDM2、LCK、IGF1具有較好的結(jié)合活性；Tet與MAPK14、細(xì)胞凋亡蛋白酶3(CASP3)具有一定的結(jié)合活性；同時(shí)，從表1也可發(fā)現(xiàn)，11個(gè)核心靶點(diǎn)具有很好的抗腫瘤相關(guān)性，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了PharmMapper預(yù)測靶點(diǎn)的可靠性。

表1 粉防己堿抗腫瘤靶點(diǎn)篩選結(jié)果

表2 粉防己堿核心抗腫瘤靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

2.4 靶蛋白-通路網(wǎng)絡(luò)特征分析 代謝通路富集分析可以將相似生物學(xué)功能靶點(diǎn)聚集形成功能模塊，形成生物學(xué)功能模塊。為進(jìn)一步闡明Tet的抗腫瘤作用，將預(yù)測出的86個(gè)抗腫瘤靶點(diǎn)通過KOBAS 3.0進(jìn)行GO富集和KEGG通路注釋分析，利用Omicshare平臺進(jìn)行作圖。GO富集分析包括3個(gè)分支，即生物過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和細(xì)胞組分(Cellular component)，見圖3。其中在生物過程cellular process、metabolic process、single-organism process、response to stimulus、response to regulation靶點(diǎn)富集較集中；在細(xì)胞組分中與cell和cell part相關(guān)性最大；在分子功能中binding和catalytic activity靶點(diǎn)相對集中富集。通過KEGG生物途徑富集分析，識別Tet顯著影響的生物途徑，其中P<0.05生物通路共有134條，P值最小的前20個(gè)的生物途徑見圖4，節(jié)點(diǎn)的顏色與大小由相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量和P決定，顏色從綠色到紅色反映了P值從大到小，節(jié)點(diǎn)從大到小反映了相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量從多到少。結(jié)果表明，Tet的抗腫瘤活性機(jī)制主要涉及腫瘤通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、代謝通路(Metabolic pathways)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、蛋白聚糖腫瘤通路(Proteoglycans in cancer)等信號通路，從而也體現(xiàn)了Tet多途徑的作用特點(diǎn)。

圖3 粉防己堿抗腫瘤靶蛋白的GO富集分析

圖4 粉防己堿KEGG 通路富集分析

3 討論

本文運(yùn)用反向分子對接[12]和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對Tet抗腫瘤作用的潛在靶點(diǎn)和可能作用的機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示，Tet可通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗腫瘤作用，與中藥作用成分多靶點(diǎn)、多途徑的特性相符。

3.1 Tetrandrine抗腫瘤相關(guān)靶基因的研究 對富集的抗腫瘤靶基因進(jìn)一步分子對接驗(yàn)證分析可知，Tet主要作用于ESR1、NOS3、PPARG、ALB、NR3C1、MDM2、LCK、IGF1等靶蛋白基因，通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)可以看出，相關(guān)靶基因具有一定相關(guān)性，進(jìn)而說明Tet具有多靶點(diǎn)抗腫瘤的潛在活性。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38 MAPK及BMK1(Big MAP kinase 1)通路。MAPK14，亦稱為p38-α，是MAPK信號傳導(dǎo)通路中的重要的信號分子，研究發(fā)現(xiàn)，Tet可通過激活p38 MAPK信號誘導(dǎo)結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞凋亡，亦可通過抑制ERK磷酸化來增強(qiáng)對A549肺癌細(xì)胞的凋亡作用[13-14]。Cui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可通過下調(diào)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)器(B2CL1 /BCL2)和激活CASP3發(fā)揮抗喉癌干細(xì)胞的作用，此抗腫瘤通路也被證實(shí)在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中[16]，并進(jìn)行了系統(tǒng)藥理學(xué)的驗(yàn)證。WU等[17]研究報(bào)道，Tet可通過介導(dǎo)下調(diào)人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP-5)的表達(dá)，進(jìn)而使Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失活發(fā)揮抗結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，但Tet是否具體作用于IGF1靶點(diǎn)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。Jang[18]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可通過降低PPARG的表達(dá)或磷酸化達(dá)到抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂肪生成的作用，亦可通過降低脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOS的mRNA表達(dá)水平抑制其活化[19]，但是Tet對PPARG和NOS3在腫瘤通路中的研究未見報(bào)道。

ESR1是一種雌激素依賴的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族的成員，能夠通過與雌激素結(jié)合并轉(zhuǎn)移至乳腺癌細(xì)胞核中，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄信號通路，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。目前臨床上許多抗癌藥物(如來曲唑、依西美坦、他莫昔芬等)的作用機(jī)制就是利用和控制這個(gè)節(jié)點(diǎn)，干擾或阻滯雌激素與雌激素受體的結(jié)合，對乳腺癌進(jìn)行治療[20-21]。Tet對ESR1靶蛋白的作用，目前尚未見報(bào)道。ALB作為血液系統(tǒng)的重要組分，是親水性的蛋白，可滲入腫瘤組織，卻不能進(jìn)入正常組織，它的這種高的通透性和滯留性被作為抗癌藥物載體已有大量研究報(bào)道[22-23]。在腫瘤細(xì)胞中，腫瘤內(nèi)皮表達(dá)的GP60受體蛋白對ALB有高度的親和力，GP60參與ALB和相關(guān)大分子藥物復(fù)合物的吸收和分布[24]。Tet雖然具有非常好的生物活性，但是它是親脂性的，基于PPI網(wǎng)絡(luò)分析，ALB可作為Tet的藥物載體，為深入研究Tet抗腫瘤作用提供了一個(gè)很好的思路。NR3C1為細(xì)胞核糖皮質(zhì)激素受體，是一種配體依賴性核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過NR3C1 介導(dǎo)，涉及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝、遷移及免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)方面，對多種類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要的調(diào)節(jié)作用[25]。Tet對NR3C1靶蛋白的作用，目前尚未見報(bào)道。MDM2 是一種 E3 泛素連接酶，可以使 p53 泛素化并被蛋白酶體降解，MDM2在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，不僅能抑制p53的活性，還會導(dǎo)致p53基因突變。近年來小分子MDM2抑制劑(如Idasanutlin、NVP-CGM097和APG-115等)已有多個(gè)化合物進(jìn)入不同階段的臨床研究[26]。因此，阻斷MDM2的功能，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，可作為Tet一個(gè)新的抗腫瘤的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行研究。LCK是一種在T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中表達(dá)的Src家族的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，其對T細(xì)胞的發(fā)育、激活和T細(xì)胞抗原受體的信號通路都起著重要作用。LCK激酶在細(xì)胞中的異位表達(dá)可以誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生癌變，因此直接選擇性抑制LCK可以為T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病、炎癥性疾病、白血病和實(shí)體腫瘤等提供良好的治療[27]。Tet對Lck靶蛋白的作用，目前尚未見報(bào)道。

3.2 Tetrandrine相關(guān)生物過程和信號通路的研究 腫瘤是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多基因與信號通路。GO生物過程富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞過程、代謝過程、刺激應(yīng)答、催化活性和細(xì)胞周期的調(diào)控等生物過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。結(jié)合KEGG基因富集數(shù)目和富集因子(圖4)可以得知，腫瘤通路、PI3K-Akt信號通路、代謝通路、胰島素抵抗、蛋白聚糖腫瘤通路等信號通路等是Tet發(fā)揮抗腫瘤活性的主要通路。Xu等[28]報(bào)道，Tet可通過caspase級聯(lián)調(diào)控、細(xì)胞周期阻滯、激活MAPK和抑制PI3K/Akt/mTOR信號途徑來誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素抵抗的人白血病Jurkat T細(xì)胞凋亡。Tet通過靶向RAS信號通路的不同效應(yīng)分子在體內(nèi)外抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤和肺癌的生長[2]。Liu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Tet通過激活caspase級聯(lián)和抑制PI3K/Akt信號通路，對前列腺癌DU145和PC-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有較強(qiáng)的抑制作用。武建毅等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Tet可抑制Akt和NF-κB信號通路誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，此通路的抑制也可明顯誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549的凋亡[31]?？傊?，雖有一些通路未被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但大量研究[2,32]仍提示Tet在腫瘤治療中有很好的應(yīng)用前景。

綜上所述，這些靶基因參與了多種腫瘤通路，對于判斷腫瘤發(fā)展過程和治療效果預(yù)測，降低復(fù)發(fā)率和死亡率，延長生存期都具有重要意義，如在甲狀腺癌患者中ESR1的高表達(dá)提示有不良的總生存周期[33]；IGF-IR表達(dá)陰性的結(jié)直腸癌患者的累積生存率和平均生存時(shí)間均顯著高于IGF-IR表達(dá)陽性的結(jié)直腸癌患者[34]。因此，本文通過反向?qū)拥姆椒▽et抗腫瘤的潛在的人源靶蛋白進(jìn)行了虛擬篩選研究，并進(jìn)一步探討了潛在靶蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及其KEGG通路研究，結(jié)果顯示所得預(yù)測的部分潛在抗腫瘤靶點(diǎn)和通路已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在一定程度上確證了本研究有關(guān)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的準(zhǔn)確性，預(yù)測的一些新靶標(biāo)和通路為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究指引了新方向，也為以Tet為基礎(chǔ)的創(chuàng)新抗腫瘤藥物研制奠定了基礎(chǔ)。