楊 玥，楊再波，賀銀菊，蘇 軍，劉嬌嬌，鄧 焦，郭銀粉，梁馨亓

(1 黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻 558000；2 福泉市中醫(yī)醫(yī)院，貴州 福泉 550500)

拐棗(Hovenia acerba Lindl.)又名：萬壽果、金鉤梨、雞爪子、龍爪、蜜爪爪等等，屬鼠李科(Rhamnactae)落葉喬木，在我國分布廣泛，主要分布在甘肅、陜西、河南、安徽、廣東、廣西、湖南、湖北、四川、云南、貴州等省區(qū)，由于果序軸肥厚、肉質(zhì)多汁，營養(yǎng)豐富，可生食、釀酒、制醋、熬糖、加工果汁飲料等，民間常用以浸制“拐棗酒”。具有解酒、通利二便、祛風(fēng)通絡(luò)止痙、止渴除煩、降血壓等作用[1-4]。

黃酮類化合物是一類存在于自然界的重要天然有機(jī)化合物，是植物的重要次生代謝產(chǎn)物，也是一類重要的中藥有效成分和一種新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)素[5]。具有抗炎癥、抗過敏、抑制病毒、防治肝病、防治血管疾病、防治血管栓塞、防治心與腦血管疾病、抗腫瘤、消除疲勞、抗脂肪氧化、抗衰老、降血脂、降血壓等多種功效[6-10]。因此，我們對(duì)拐棗與拐棗制成的養(yǎng)生酒中的總黃酮含量進(jìn)行分析比較，旨在為拐棗養(yǎng)生保健產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與原料

乙醇，蘆丁(純度為99%)，5%亞硝酸鈉溶液，10%硝酸鋁溶液，5%氫氧化鈉溶液等。野生拐棗(產(chǎn)地都勻市)，56°食用白酒(原料大米，產(chǎn)地都勻市)。

1.1.2 儀 器

JK-LIC-480DE超聲波清洗機(jī)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋；FW-80高速萬能粉碎機(jī)；AUY-220分析天平；9070MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)備：精密稱取蘆丁對(duì)照品 20.0 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入95%乙醇溶液并稀釋至刻度，搖勻即得含蘆丁0.20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液[6]。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、12.00 mL分置于50 mL容量瓶中，各加95%乙醇12 mL，加5%亞硝酸鈉溶液2 mL，混勻，放置 6 min，再加10%硝酸鋁溶液2 mL，混勻，放置6 min，加5%氫氧化鈉試液20 mL，最后用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，以第一瓶為空白溶液，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，在510 nm上測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果可見表1。

1.2.2 拐棗中總黃酮含量的測(cè)定[11-19]

(1)將市售新鮮拐棗烘干，攪碎，然后分別稱取2 g，置于三個(gè)100 mL錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶2.0000 g，分別加入70%的乙醇溶液50 mL進(jìn)行超聲波提取，溫度70 ℃，提取30 min，冷卻后分別過濾，然后分別將濾液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，最后用70%的乙醇溶液定容，作為總黃酮待測(cè)液。

(2)分別精密吸取上述三個(gè)總黃酮待測(cè)液2.00 mL，分別移至50 mL容量瓶中，然后分別加95%乙醇12 mL，分別加5%亞硝酸鈉溶液2 mL，混勻，放置6 min，再分別加10%硝酸鋁溶液2 mL，混勻，放置6 min，分別加5%氫氧化鈉試液20 mL，最后分別用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，在510 nm上測(cè)定吸光度A，平行三次。按照回歸方程計(jì)算樣品總黃酮含量，結(jié)果可見表5。

1.2.3 拐棗養(yǎng)生酒總黃酮含量的測(cè)定[11-20]

(1)稱取100 g拐棗，將其放入酒壇中，然后加入56度的食用白酒1000 g，然后密封保存，每天振搖2～3次，21天后，將其過濾，用56度的食用白酒將其定容到1000 mL，即得拐棗養(yǎng)生酒，將此拐棗酒作為總黃酮的待測(cè)液。

(2)精密吸取拐棗酒總黃酮待測(cè)液3.00 mL，并移于50 mL 容量瓶中，然后加95%乙醇12 mL，加5%亞硝酸鈉溶液2 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液2 mL，混勻，放置6 min，加5%氫氧化鈉試液20 mL，最后用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，在510 nm上測(cè)定吸光度A，平行三次，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算拐棗養(yǎng)生酒總黃酮含量。結(jié)果見表6。

1.2.4 總黃酮含量計(jì)算公式

C——根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的黃酮濃度，mg/mL

N——稀釋倍數(shù)

V——最初提取液的體積，mL

m——提取用拐棗的質(zhì)量，g

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

由上述方法1.2.1可得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，由表1可知，得回歸方程A=0.00782C+0.04415，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.9998，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8.0～48.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

2.2 分析方法的驗(yàn)證

2.2.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

以拐棗樣品制備來研究分析方法的重復(fù)性，同時(shí)精密稱量2.0000 g拐棗樣品6份，按照上述1.2.2方法進(jìn)行樣品制備和分析總黃酮含量，分析結(jié)果如表2所示。根據(jù)回歸方程計(jì)算出總黃酮含量，6次平行實(shí)驗(yàn)得到的重復(fù)性，由表2可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.11%。

表2 拐棗中總黃酮含量方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.2 回收率實(shí)驗(yàn)

以拐棗樣品制備來研究分析方法的回收率，取已測(cè)定含量的樣品，添加一定的標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁，測(cè)定回收率。結(jié)果見表3。由表3可計(jì)算出，其平均回收率為91.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.55%(n=6)。

表3 拐棗樣品分析方法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選標(biāo)準(zhǔn)溶液中的1號(hào)、3號(hào)，5號(hào)與其中一個(gè)樣品管來測(cè)定其吸光度后，然后分別放置10、20、30、60和90 min后，再分別測(cè)定其吸光度，結(jié)果見表4。由表4可以發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品在放置30、60和90 min后，其吸光度的值相對(duì)比較穩(wěn)定。

表4 拐棗總黃酮分析方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 方法的檢出限

對(duì)其進(jìn)行了20次全試劑空白吸光度平均值為0.002，按3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算該方法的檢出限為0.2 μg/mL。

2.3 總黃酮含量分析

2.3.1 拐棗中總黃酮含量分析

根據(jù)上述方法1.2.2對(duì)拐棗中總黃酮含量測(cè)定，結(jié)果分析見表5。由表5可知，拐棗的總黃酮平均含量為12.93 mg/g，總黃酮平均提取率為1.30%。

表5 拐棗中總黃酮含量

2.3.2 拐棗養(yǎng)生酒中總黃酮含量分析

根據(jù)上述方法1.2.3對(duì)拐棗養(yǎng)生酒中總黃酮含量測(cè)定，結(jié)果分析見表6。由表6可知，拐棗養(yǎng)生酒中的總黃酮平均含量為1.48 mg/g，總黃酮平均浸出率為0.15%。從結(jié)果分析中，可以看出拐棗養(yǎng)生酒中總黃酮含量比拐棗中總黃酮含量低，可能原因是浸泡拐棗的時(shí)候由于白酒溶液進(jìn)入拐棗的細(xì)胞壁中浸出黃酮類物質(zhì)，在細(xì)胞壁內(nèi)外之間濃度差為自然浸泡推動(dòng)力，當(dāng)細(xì)胞壁內(nèi)外達(dá)到一定的濃度后形成了濃度平衡，所以拐棗浸泡出總黃酮含量比拐棗要低。因此，要提高拐棗養(yǎng)生酒中的總黃酮含量就必須破壞這一濃度平衡，即可提高浸出濃度。

表6 拐棗養(yǎng)生酒的總黃酮含量

3 結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)研究表明，在波長510 nm下，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度在8.0～48.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9998。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了分析方法的驗(yàn)證，建立的方法重復(fù)性相對(duì)偏差為2.11%；平均回收率為91.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.55%(n=6)；并進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明在60 min內(nèi)比較穩(wěn)定；建立的分析方法的檢出限為0.20 μg/mL。說明我們建立的實(shí)驗(yàn)分析方法步驟簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，精密度高，在90 min 以內(nèi)不受放置時(shí)間的影響。采用建立的分析方法對(duì)樣品進(jìn)行分析，拐棗中的總黃酮含量為12.93 mg/g，提取率為1.29%；而拐棗養(yǎng)生酒中的總黃酮含量為1.48 mg/g，浸出率為0.15%。由此可知拐棗中含有豐富的黃酮類化合物，研究結(jié)果，能夠?yàn)楣諚椬鳛楸＝○B(yǎng)生品來開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。