金中淦， 居 漪， 張素潔， 李 卿， 歐元祝， 虞嘯炫， 孫賀偉， 范霄宇， 虞科穎

（1. 上海市臨床檢驗中心參考測量實驗室，上海 200126；2.上海市臨床檢驗中心臨床生化免疫學研究室，上海 200126）

葡萄糖（glucose，Glu）是臨床實驗中重要的檢測項目，血糖監(jiān)測是糖尿病診斷和治療的重要環(huán)節(jié)，其結果有助于評估糖尿病患者血糖代謝情況，可幫助臨床制定治療方案，并監(jiān)測療效。因此，臨床實驗室Glu檢測質量在糖尿病管理中具有重要作用[1-2]。能力比對檢驗（proficiency testing，PT）/室間質量評價（external quality assessment，EQA）活動是目前管理和提高臨床實驗室檢測質量的常用方式，通常依據(jù)方法學或檢測系統(tǒng)進行分組統(tǒng)計，靶值為組內均值或中位值[3]。本研究擬運用國際檢驗醫(yī)學溯源聯(lián)合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）公布的同位素稀釋氣相色譜串聯(lián)質譜（isotope dilution gas chromatography tandem mass spectrometry，IDGC/MS）Glu參考方法[4]確定EQA樣本靶值，探索其在EQA中的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集參加上海市臨床檢驗中心2018年第2次常規(guī)化學EQA活動的509家各級、各類醫(yī)院的醫(yī)學實驗室及獨立實驗室反饋結果。

1.2 樣品

正確度物質為美國國家標準與技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）標準物質SRM 965b（-70℃保存）及國際臨床化學協(xié)會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）提供的RELA-A和RELA-B。EQA樣品為2018年第2次EQA活動的5份樣本，編號分別為EQA1、EQA2、EQA3、EQA4和EQA5，均為凍干血清，依據(jù)中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）-GL03-2006《能力驗證計劃樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》評估樣品的均一性和穩(wěn)定性[5]。

1.3 儀器與試劑

Glu標準品SRM 917c，純度為（99.7±0.3）%，購自NIST；13C6-D-Glu標記物同位素豐度為99%，購自美國Cambridge Isotope laboratories公司；乙腈（質譜級）、乙酸（質譜級）購自美國Fisher公司，乙酸酐購自國藥集團。Agilent G7000B氣相質譜儀、HP-5MS UI毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）均購自美國Agilent公司，梅特勒-托勒多分析天平（Max=220 g，d=0.1 mg）購自德國METTLER公司，氮氣儀購自美國THERMO公司。

1.4 參考方法賦值

上海市臨床檢驗中心參考測量實驗室是通過CNAS ISO/IEC17025/15195認可的實驗室，被認可的項目包括血清Glu。賦值過程：（1）樣品前處理，在血清樣品中加入適量Glu標記物溶液，使血清中Glu的含量與Glu標記物含量之比約為1，加入適量無水乙醇去除蛋白質，10 000×g離心10 min，收集上清液至另一管中；（2）衍生化反應，取收集的上清液200 μL至另一樣品瓶中，60 ℃氮氣吹干后，加入鹽酸羥氨吡啶溶液（0.6 mol/L）200 μL，混勻，90 ℃條件下反應1.5 h，冷卻后加乙酸酐300 μL，90 ℃條件下反應1 h，60 ℃氮氣吹干，用400 μL二氯甲烷復溶，進行ID-GC/MS分析；（3）ID-GC/MS條件，以分流模式進樣，分樣流比為20∶l。進樣口溫度設定為270 ℃，氦氣流速為1.0 mL/min，初始爐溫為150 ℃，持續(xù)1 min，再以30 ℃/min的速率升至180 ℃，持續(xù)1 min，再以20 ℃/min的速率升至280 ℃，持續(xù)1 min。離子源溫度250 ℃，電離能為70 eV。選擇離子監(jiān)測模式下采集質荷比（m/z）314和319，掃描時間為200 ms。進樣量為1 μL；（4）測定過程，參考方法賦值過程依據(jù)本實驗質譜法樣品賦值標準操作規(guī)程進行，分3批次測定，每批次每個濃度樣品重復前處理3份樣本，每份樣本與標樣同步測定，按低標-樣品（含質控）-高標的次序進樣，每份樣本最少重復測定3次，要求3次進樣檢測結果的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜2%，否則需要再增加進樣次數(shù)至滿足要求，以3次進樣的均值作為每份樣本的有效實驗結果。

1.5 臨床實驗室EQA過程

樣本通過上海市臨床檢驗中心指定冷鏈系統(tǒng)運送到參評實驗室，各參評實驗室按照標準操作規(guī)程測量樣本，記錄測量結果，并通過網(wǎng)絡平臺上傳測定結果、所用儀器、方法等相關信息。

1.6 統(tǒng)計學方法

使用上海市臨床檢驗中心EQA評價管理平臺及Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)的分析處理，計算中位數(shù)及偏移。

2 結果

2.1 參考方法性能

Glu參考方法測量不精密度≤2.0%，測量參考物質相對偏移＜1.0%。本實驗室參加IFCC參考實驗室網(wǎng)絡比對，測定結果均在規(guī)定的等效限內。見表1。

表1 參考方法主要性能評價

2.2 EQA樣本賦值結果

實驗過程中同步測定正確度物質，要求正確度物質測定結果在靶值允許偏移范圍內，否則該批次實驗結果無效。參考方法為EQA樣本定值結果。見表2。

表2 參考方法測定血清Glu結果

2.3 EQA結果分析

2.3.1 按照Glu檢測的不同方法對調查結果進行分析 按照Glu檢測方法對檢測結果進行分析，不同方法測定的Glu水平中位值與參考方法定值結果的相對偏移為-2.22%～4.51%，見圖1。按WS/T 403-2012[6]中偏移2%的評價標準，其中己糖激酶法5個濃度的測定值與參考方法確定靶值的相對偏移均＜2%。

圖1 不同方法測定的Glu濃度與參考方法確定靶值的相對偏移

2.3.2 按照不同檢測系統(tǒng)對結果進行分析 不同常規(guī)分析系統(tǒng)測定的血清Glu濃度中位數(shù)與參考方法確定靶值的相對偏移見圖2。13個系統(tǒng)檢測EQA1～5結果中位數(shù)與參考方法確定靶值的相對偏移分別為-1.71%～3.47%、-0.17%～3.75%、-2.3%～3.60%、0.50%～7.52%、-1.70%～3.23%。按WS/T 403-2012[6]中偏移2%的評價標準，只有7.69%（1/13）的常規(guī)分析系統(tǒng)測定的5個Glu結果與參考方法定值的相對偏移＜2%，有61.54%（8/13）的系統(tǒng)只有1個結果與參考方法定值的相對偏移＞2%，有15.38%（2/13）的系統(tǒng)2個結果與參考方法定值的相對偏移均＞2%，有7.69%（1/13）的系統(tǒng)3個結果與參考方法定值的相對偏移＞2%，有7.69%（1/13）的系統(tǒng)測定的5個Glu濃度與參考方法定值的相對偏移＞2%。

圖2 不同常規(guī)分析系統(tǒng)測定的血清Glu濃度與參考方法賦值結果的相對偏移

2.3.3 EQA結果分析 分別以實驗室所有數(shù)據(jù)中位數(shù)、參考方法定值為靶值，并且以WS/T 403-2012[6]中允許總誤差的7%評價實驗室合格率，結果見表3。

表3 實驗室合格率

3 討論

EQA中靶值的正確性、客觀性一直是質量評價機構努力的方向。本研究主要利用Glu參考方法確定EQA樣本靶值，初步探討其在上海地區(qū)EQA工作中的可行性。

本實驗室Glu參考方法已通過2018年CNAS ISO/IEC17025/15195認可[7]，并于2019年通過JCTLM評審認可，該項目的檢測能力已獲得國際組織認可，可以為全球提供賦值服務，保證了本實驗室檢測靶值的可靠性。我們所分析的上海地區(qū)509家臨床實驗室的數(shù)據(jù)，不同檢測原理測定的Glu濃度中位數(shù)與參考方法確定靶值的相對偏移為-2.22%～4.51%，己糖激酶法5個濃度的測定值與參考方法確定靶值的相對偏移均＜2%，顯示出較好的正確性。己糖激酶法的特異性高于葡萄糖氧化酶法，是公認的血糖測定的參考方法，己糖激酶法常規(guī)分析方法原理與參考方法類似，因此其測定準確性是比較高的。

按照檢測系統(tǒng)進行分組分析，大部分系統(tǒng)測定的Glu濃度與參考方法賦值結果的相對偏移與行業(yè)標準中2%偏移的要求還存在一定距離，但大部分系統(tǒng)是能夠滿足1/2允許總誤差的要求。張傳寶等[8]用參考方法對血清進行賦值，并用標準物質SRM 965a對系統(tǒng)進行校準，評價了13種Glu常規(guī)檢測系統(tǒng)的正確性，校準前大部分系統(tǒng)為正偏移，與我們的研究結果一致，常規(guī)方法測定Glu的特異性問題可能是主要原因。另外，目前大部分體外診斷試劑均采用的是單一校準品，該校準品的濃度和定值準確性是臨床實驗室檢測結果的重要保證。

以行業(yè)標準中允許總誤差7%來評價實驗室合格率，當靶值為所有實驗室檢測結果的中位數(shù)時，EQA1～5不合格率分別為2.16%、2.95%、3.34%、3.14 %、1.77%；當靶值為參考方法賦值結果評價時，EQA1～5不合格率分別為2.75%、3.14%、2.75%、7.86%、2.16%。提示不同的靶值對實驗室來講，可能會導致不同的質量評價結果。CNAS-GL002：2018《能力驗證結果的統(tǒng)計處理和能力評價指南》[9]指出，在能力驗證中指定值的確定方式有多種，除去采用已知值和有證參考值外，參考方法賦值比采用參加者公議值為指定值等級高，不確定度要小[9]，可以適當減少均值或中位數(shù)的偏移導致靶值出現(xiàn)偏差的情況，提高靶值和質量評價的客觀性。EQA的關鍵是掌握樣本的互換性及靶值的設定過程，本研究主要探討靶值的設定過程，對于樣本的互換性，需進一步探討。值得注意的是，EQA樣品雖為人血清基質，但為了滿足保存和運輸?shù)囊螅赡軙砑右欢ǖ姆€(wěn)定劑，因此對于臨床實驗室檢測EQA4樣本出現(xiàn)的較大偏差是來自于系統(tǒng)的正確性問題還是樣本存在的互通性問題，仍需進一步研究。EQA4樣本濃度在4 mmol/L左右，為較低水平的濃度，而本實驗室認可的參考測量范圍是1.8～26.3 mmol/L，校準和測量能力為1.4%，故參考方法定值的準確性比較高。對于低濃度Glu的準確測量是值得被關注的。當血糖濃度為3.4～3.9 mmol/L時，約有29.92%糖尿病住院患者易發(fā)生有癥狀低血糖；而當血糖值為2.8～3.3 mmol/L時，約31.80%糖尿病住院患者易發(fā)生無癥狀低血糖[10]。低血糖的危害主要是對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，因此應及時檢測血糖，提高低血糖的診斷準確率，以達到早期預防、及時干預的目的，減少低血糖的臨床危害[2]。后續(xù)我們將著手2方面的工作：一是嘗試開展正確度驗證工作，使用新鮮冰凍血清考察臨床實驗室檢測水平；二是研究EQA樣本的互換性，因常規(guī)EQA樣本在保存、運輸及成本上相對正確度樣本具有較大優(yōu)勢，因此有必要評價選擇質量較高的EQA樣本，并且制定合理的EQA評價方案，為提高臨床實驗室檢測質量發(fā)揮作用。目前較高質量EQA樣本的獲得需要實驗室、質量評價機構及體外診斷試劑企業(yè)的共同努力[11]。

綜上所述，如何確立靶值在臨床實驗室質量管理中有重要意義。參考方法可在推動臨床實驗室量值溯源工作、提高實驗室檢測質量中起一定作用。質量監(jiān)管機構應關注EQA樣本的質量，臨床實驗室應關注低濃度Glu測量的可靠性。