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檢測多天線AAG的Lectin-ELISA方法建立及初步應用評價

2020-12-03 01:44:38關雯倩高致遠馮惠娟何羽童高春芳
檢驗醫(yī)學 2020年11期
關鍵詞:糖鏈糖基化癌癥

關雯倩, 高致遠, 馮惠娟, 洪 松, 何羽童, 何 璐, 高春芳

(上海東方肝膽外科醫(yī)院實驗診斷科,上海 200438)

α1-酸性糖蛋白(alpha 1-acid glycoprotein,AAG)是由肝細胞合成、分泌的一種急性時相反應蛋白[1],等電點為2.8~3.8,糖含量高達42%[2]。人血清AAG分子是一條具有183個氨基酸的多肽鏈,相對分子質(zhì)量為41 000~43 000,含有5個N-linked糖基化位點(Asn-15、Asn-38、Asn-54、Asn-75、Asn-85),每個糖基化位點均可能表達具有不同分枝數(shù)的糖鏈結(jié)構(gòu)[3],多天線糖鏈結(jié)構(gòu)主要是指有3條或3條以上分枝的糖鏈。血清中糖蛋白的含糖量多在20%以下,AAG的含糖量在所有糖蛋白中處于較高水平,且唾液酸含量高達15%,并以α2-3或α2-6的方式與半乳糖連接[4]。唾液酸帶負電荷,這也是AAG等電點較低的原因。由于AAG具有抗中性粒細胞和抗補體活性,因此被認為是一種天然的抗炎蛋白和免疫調(diào)節(jié)劑[5]。AAG還具有維持毛細血管通透性的功能,可提高血管內(nèi)皮細胞的陰離子選擇性[6]。此外,AAG還具有抑制血小板聚集等功能[7]。AAG的多種生物學活性都依賴于其糖基化修飾,如抑制淋巴細胞增殖的功能依賴于其糖鏈分枝水平[8];AAG經(jīng)去唾液酸處理后,其抑制血小板聚集的功能加強[9];AAG可通過N-linked糖鏈結(jié)合1型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus 1,HIV-1),抑制病毒包膜蛋白結(jié)合CD4+單核細胞[10]。AAG糖基化改變并不僅限于急性炎癥條件下,在其他病理生理條件下也會發(fā)生相應變化,如妊娠、類風濕性關節(jié)炎、酒精性肝硬化、肝炎等[11-14]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,糖基化位點和糖鏈結(jié)構(gòu)均可能出現(xiàn)異常改變,通過對比正常人和疾病患者的糖基化狀況,可能會發(fā)現(xiàn)能用于臨床的新腫瘤標志物。在卵巢癌、胰腺癌等腫瘤中,AAG的糖基化改變已有相關報道[15]。在原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中,異常巖藻糖基化的AAG增加也有相關報道[16]。糖鏈分枝數(shù)增加也是腫瘤中常見的異常糖基化形式。目前,關于HCC中AAG的多天線糖鏈改變情況尚缺乏相關的文獻報道。為闡明HCC患者血清多天線AAG的變化情況,本研究擬構(gòu)建一種凝集素-酶聯(lián)免疫吸附試驗(lectin enzyme-linked immunosorbent assay,Lectin-ELISA)檢測體系,初步評價多天線AAG對HCC患者的診斷價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年—2018年的患者457例,包括HCC 220例[HCC組,其中男193例、女27例,年齡(50.3±8.22)歲]、肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)74例[ICC組,其中男64例、女10例,年齡(55.72±10.18)歲]、肝硬化(liver cirrhosis,LC)120例[LC組,其中男106例、女14例,年齡(51.45±11.07)歲]、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)43例[CHB組,其中男40例、女3例,年齡(51.02±10.31)歲],其中220例HCC患者、74例ICC患者和32例LC患者的血清樣本收集于上海東方肝膽外科醫(yī)院,79例LC患者和4例CHB患者的血清樣本收集于海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院,8例LC患者的血清樣本收集于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第962醫(yī)院;8例CHB患者的血清樣本收集于沈陽軍區(qū)總院;27例CHB患者的血清樣本收集于濟南傳染病院;4例CHB的血清樣本收集于臺州市第一人民醫(yī)院;1例LC的血清樣本收集于福州孟超肝膽醫(yī)院。根據(jù)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng),盡可能全面地收集所有患者的一般資料、 臨床實驗室指標及病理診斷結(jié)果。HCC患者病理診斷結(jié)果包括:腫瘤的大小、腫瘤數(shù)目、衛(wèi)星結(jié)節(jié)、大血管癌栓、腫瘤包膜、分化程度、微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)、肝硬化情況等。每例患者臨床血常規(guī)、肝功能、腫瘤標志物、凝血系統(tǒng)功能檢查、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)標志物等臨床檢測數(shù)據(jù)與血清樣本同期收集。選取同期上海東方肝膽外科醫(yī)院體檢健康者80名(正常對照組),其中男70名、女10名,年齡(51.46±8.34)歲。各組間性別、年齡均相互匹配。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會批準,所有對象均簽署知情同意書。

1.2 入選和排除標準

HCC均為經(jīng)術后病理檢查明確診斷。排除標準:(1)合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等感染;(2)患繼發(fā)性肝癌、其他器官惡性腫瘤、嚴重感染及其他器官嚴重疾病等。HCC分期依據(jù)TNM標準[美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版]。T1期:單個腫瘤<2 cm或>2 cm但無血管浸潤;T2期:單個腫瘤>2 cm,伴有血管浸潤,或多發(fā)性腫瘤且均<5 cm;T3期:多發(fā)性腫瘤,其中至少1個>5 cm;T4期:任意大小的單個或多個腫瘤侵犯門靜脈或肝靜脈,或腫瘤直接侵犯膽囊以外的臨近器官或腹膜臟層。

ICC均經(jīng)術后病理明確診斷。LC均經(jīng)過臨床表現(xiàn)和影像學檢查確診的HBV相關LC患者,排除自身免疫性肝病、酒精性肝病,藥物性肝病及其他原因引起的慢性肝病、Wilson病、腎功能不全、血液病等。CHB均為乙型肝炎表面抗原陽性持續(xù)6個月以上的患者。

1.3 血清樣本采集

采用促凝管采集所有對象靜脈血3~4 mL,室溫靜置30 min,1 500×g離心10 min,吸取血清置于專用的Eppendorf管中,300~500 μL/管,-80 ℃保存。

1.4 實驗室常規(guī)檢測指標

肝功能指標均采用Modular P800全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)及配套試劑檢測。相關指標參考區(qū)間分別為總蛋白(total protein,TP)65~85 g/L,白蛋白(albumin,Alb)40~55 g/L,總膽紅素(total bilirubin,TB)3.4~21.0 μmol/L,直接膽紅素(direct bilirubin,DBil)<6.84 μmol/L,總膽汁酸(total bile acid,TBA)<12 μmol/L,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)9~50 U/L,天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)15~40 U/L,γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT)10~60 U/L,堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)45~125 U/L,唾液酸(sialic acid,SA)456~754 mg/L,白蛋白/球蛋白(albumin/globulin,A/G)比值1.5~2.5。

血常規(guī)指標采用XE-2100D全自動血液分析儀(日本Sysmex公司)及配套試劑檢測。相關指標參考區(qū)間分別為白細胞(white blood cell,WBC)計數(shù)(3.5~9.5)×109/L,血小板(platelet,PLT)計數(shù)(125~ 350)×109/L,紅細胞(red blood cell,RBC)計數(shù)男性(4.0~5.5)×109/L、女性(3.5~5.0)×109/L,血紅蛋白(hemoglobin,Hb)男性120~160 g/L、女性110~150 g/L。

腫瘤標志物采用cobas e601電化學發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)(瑞士羅氏公司)及配套試劑檢測。相關指標參考區(qū)間分別為甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)<20 μg/L,癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)<10 μg/L,糖類抗原(carbohydrate antigen,CA)19-9<39 U/mL。甲胎蛋白異質(zhì)體(alpha-fetoprotein variant,AFP-L3)檢測試劑盒購自北京熱景公司,參考區(qū)間為<10%。

1.5 主要試劑和儀器

酶標板購自德國Greiner Bio One公司,AAG抗體(ab118809)購自英國Abcom公司,Coating buffer(#421701)購自美國BioLegend公司,Biotinylated DSA(B-1185)、Carbofree coating buffer(SP-5040)購自美國Vector公司,LowCross-buffer購自德國Candor Bioscience公司,Peroxidase-conjugated avidin、Substrate Reagent Pack(DY999)購自美國RD公司,磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)(20×)、Tween-20購自上海博光生物科技有限公司,Stop solution購自上海西塘生物公司。移液器購自美國Gilson公司,恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏儀器設備有限公司,Gen5酶標儀購自美國BioTek Instruments公司,BN-Ⅱ特定蛋白分析儀購自德國西門子公司。

1.6 方法

1.6.1 Lectin-ELISA的建立 根據(jù)曼陀羅凝集素(Datura stramonium agglutinin,DSA)可特異性識別多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的原理[17]構(gòu)建檢測多天線AAG的Lectin-ELISA方法。采用AAG抗體包被酶標板,捕獲血清樣本中的目的蛋白AAG,采用DSA特異性識別AAG的多天線糖鏈結(jié)構(gòu),檢測DSA與多天線AAG結(jié)合物(DSA-AAG)的水平。經(jīng)證實,抗體分子上不含多天線結(jié)構(gòu),不影響DSA對目的蛋白多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的識別和結(jié)合,因此無需對抗體分子上的糖鏈結(jié)構(gòu)進行封閉[18]。具體步驟:(1)用包被液將AAG抗體按比例稀釋后加入酶標板,每孔加入100 μL,4 ℃過夜,每孔加入400 μL洗板液洗滌4次,最后1次洗滌后用吸水紙拍干;(2)每孔加入300 μL封閉液,37 ℃孵育1 h,洗滌4次后用吸水紙拍干;(3)用LowCross-buffer將血清樣本1∶100稀釋,每份樣本加入2個孔中(雙復孔),每孔加入100 μL,室溫孵育2.5 h,洗滌4次后用吸水紙拍干;(4)用PBS將biotinylated DSA按比例稀釋,每孔加入100 μL,室溫孵育1 h,洗滌4次后用吸水紙拍干;(5)用酶稀釋液將peroxidase-conjugated avidin按比例稀釋,每孔加入100 μL,室溫孵育45 min,洗滌4次后用吸水紙拍干;(6)每孔加入配制好的辣根過氧化物酶顯色底物100 μL,室溫避光孵育30 min;(7)每孔加入50 μL終止液,輕晃酶標板混勻,10 min內(nèi)放入Gen5酶標儀檢測吸光度(A)值。

1.6.2 方法學評估 由于目前尚無多天線AAG標準品,因此以5名健康人混合血清替代標準品進行檢測。根據(jù)前期條件摸索,將混合血清以1∶5、1∶20、1∶80、1∶320、1∶1 280、1∶5 120、1∶20 480稀釋,采用建立的Lectin-ELISA進行檢測,獲得濃度梯度曲線,以此評估該方法的線性。對高、中、低值樣本重復檢測5個批次,計算該方法的批間變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)。以此評估該方法的重復性。采用Interference check A PLUS干擾檢測試劑盒(日本Sysmex公司)進行干擾試驗,干擾物質(zhì)包括游離膽紅素(free bilirubin,F(xiàn)Bil)、結(jié)合膽紅素(conjugated bilirubin,CBil)、溶血(Hb)和乳糜。按說明書要求配制干擾樣本。具體步驟:在各干擾物質(zhì)中分別加入2 mL超純水,充分溶解,取1 mL與預先制備好的混合血清樣本9 mL充分混勻,作為樣本A。在空白對照中加入2 mL超純水,充分溶解,取1 mL與預先制備好的混合血清樣本9 mL充分混勻,作為樣本B。將樣本A與樣本B按0∶1、0.2∶0.8、0.4∶0.6、0.6∶0.4、0.8∶0.2、1∶0配制成不同稀釋比例的樣本,采用建立的Lectin-ELISA檢測,判斷各干擾物質(zhì)對該方法的影響。

1.6.3 Lectin-ELISA的初步臨床應用 采用建立的Lectin-ELISA檢測所有對象的血清樣本。

1.6.4 血清AAG檢測 采用BN-Ⅱ特定蛋白分析儀及配套試劑檢測所有對象的血清AAG水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示,2個組之間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)(M)[四分位數(shù)(P25~P75)]表示,組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。采用Spearman相關分析評估各項目之間的相關性。采用Logistic回歸方法建立多指標聯(lián)合檢測模型。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評估單項指標及聯(lián)合檢測模型診斷HCC的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組一般資料的比較

HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組之間血清ALT、AST、TB、DBil、Alb、TP、AFP水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),性別及年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 方法學評估

2.2.1 線性范圍 以混合血清替代標準品進行檢測,以A值為縱坐標,以血清稀釋倍數(shù)的對數(shù)為橫坐標,繪制濃度梯度曲線,線性回歸系數(shù)r2=0.976,見圖1。HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組血清以1∶100稀釋后DSAAAG水平均在此范圍內(nèi)。

圖1 血清DSA-AAG的濃度梯度曲線

表1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組一般資料的比較 ±s

表1 HCC組、ICC組、LC組、CHB組及正常對照組一般資料的比較 ±s

組別 例數(shù) AST/(U/L) ALT/(U/L) GGT/(U/L) TB/(μmol/L)HCC組 220 29.00(20.00~42.00) 29.00(20.00~42.00) 56.00(34.00~104.5) 14.00(10.90~18.38)CHB組 43 223.00(88.00~519.00) 295.00(183.00~767.00) 114.00(63.00~165.00) 23.40(14.70~69.10)LC組 120 32.00(24.25~44.75) 27.00(18.00~40.25) 46.50(28.25~79.75) 23.85(15.00~40.15)ICC組 74 23.00(18.00~35.00) 24.50(16.00~34.25) 84.50(61.75~113.00) 14.35(10.70~18.43)正常對照組 80 20.00(16.00~25.75) 14.65(12.00~16.63)統(tǒng)計值 17.295 17.744 2.271 18.798 P值 <0.001 <0.001 0.132 <0.001組別 DBil/(μmol/L) Alb/(g/L) TP/(g/L) AFP/(μg/L)HCC組 5.50(4.10~7.10) 42.01±3.74 69.62±8.28 61.00(4.70~1 210.00)CHB組 9.60(5.20~47.00) 37.69±4.24 69.09±6.26 8.31(3.71~45.47)LC組 10.20(6.00~20.00) 33.08±10.18 63.63±16.81 3.60(2.23~8.84)ICC組 5.15(3.85~6.80) 42.26±3.46 68.67±5.12 2.90(2.00~4.70)正常對照組 47.91±1.97 75.87±3.20 3.50(2.60~3.50)統(tǒng)計值 22.056 46.845 161.700 82.406 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.2.2 批間CVLectin-ELISA檢測血清DSAAAG的批間最大CV為10.51%,滿足批間CV<15%的要求。見表2。

表2 Lectin-ELISA的批間CV

2.2.3 干擾試驗 Lectin-ELISA檢測血清DSAAAG的A值隨干擾物濃度的變化僅出現(xiàn)輕微變化,符合臨床應用要求。見圖2。

2.3 血清DSA-AAG和AAG水平

將ICC組、LC組、CHB組合并為疾病對照組,HCC組血清DSA-AAG水平顯著高于疾病對照組和正常對照組(P<0.001),且疾病對照組高于正常對照組(P<0.001)。HCC組、疾病對照組血清AAG水平明顯高于正常對照組(P<0.001),而HCC組與疾病對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

圖2 干擾物質(zhì)對Lectin-ELISA檢測DSA-AAG的干擾

表3 HCC組、疾病對照組和正常對照組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 x±s

將HCC組和ICC組合并為癌癥組,將LC組、CHB組和正常對照組合并為非癌癥組。癌癥組血清DSA-AAG和AAG水平均高于非癌癥組(P<0.001)。見表4。

HCC組血清DSA-AAG水平高于ICC組(P<0.001),血清AAG水平低于ICC組(P<0.001)。見表5。

表4 癌癥組與非癌癥組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表4 癌癥組與非癌癥組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注:與非癌癥組比較,*P<0.001

組別 DSA-AAG(A值) AAG/(g/L)癌癥組 0.46±0.08* 0.67±0.32*非癌癥組 0.43±0.10 0.52±0.28

表5 HCC組與ICC組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表5 HCC組與ICC組血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注:與ICC組比較,*P<0.001

組別 DSA-AAG(A值) AAG/(g/L)HCC組 0.47±0.07* 0.63±0.30*ICC組 0.43±0.10 0.79±0.35

2.4 HCC組DSA-AAG與臨床各項指標的相關性

HCC組DSA-AAG與AFP呈負相關(r=0.147,P<0.05),與TP、Alb、A/G比值、GGT、TB、DBil、ALT、AST、RBC計數(shù)、Hb、糖類抗原(carbohydrate antigen,CA)19-9均無相關性(r值分別為0.040、0.039、-0.017、0.052、-0.012、-0.031、0.061、0.059、-0.094、-0.056、0.001,P>0.05)。

2.5 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較

將HCC按直徑分為小肝癌(直徑<5 cm,106例)和大肝癌(直徑≥5cm,112例),大肝癌血清AAG水平高于小肝癌(P<0.001),而血清DSA-AAG水平二者之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。將HCC患者按TNM分期分為T1期(65例)、T2期(74例)和T3+T4期(79例),T3+T4期患者血清AAG水平顯著高于T1、T2期患者(P<0.001),不同分期患者之間血清DSA-AAG水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

2.6 AFP陰性HCC患者與非癌癥者血清DSAAAG水平的比較

220例HCC中有90例(40.9%)患者血清AFP為陰性(<20 ng/mL)。將肝硬化患者、CHB患者、正常對照者合并為非癌癥組。AFP陰性HCC組血清DSA-AAG和AAG水平均高于非癌癥組(P<0.001、P<0.05)。見表7。

表6 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較 ±s

表6 不同腫瘤大小和TNM分期HCC患者血清DSA-AAG和AAG水平的比較 ±s

項目 DSA-AAG(A值) AAG/(g/L)腫瘤大小/cm<5 0.47±0.08 0.53±0.22≥5 0.47±0.07 0.73±0.33 TNM分期T1期 0.47±0.07 0.58±0.27 T2期 0.47±0.09 0.52±0.22 T3+T4期 0.47±0.06 0.78±0.33

表7 AFP陰性HCC組與非癌癥者血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

表7 AFP陰性HCC組與非癌癥者血清DSA-AAG、AAG水平的比較 ±s

注:與非癌癥組比較,*P<0.05、**P<0.001

組別 DSA-AAG(A值) AAG/(g/L)AFP陰性HCC組 0.48±0.09** 0.60±0.28*非癌癥組 0.43±0.10 0.52±0.29

2.7 DSA-AAG及AAG單項及聯(lián)合檢測診斷HCC的效能

采用Logistic回歸分析建立DSA-AAG、A A G和A F P聯(lián)合檢測鑒別診斷H C C與非HCC的模型為LogitAAG1=6.578×DSA-AAG+1.445×AAG+0.013×AFP-3.258。ROC曲線分析結(jié)果顯示,DSA-AAG、AAG及AFP單項和聯(lián)合檢測模型LogitAAG1鑒別診斷HCC與非HCC的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.651、0.632、0.803和0.836,LogitAAG1的準確性(74.9%)高于DSA-AAG(63.9%)和AAG(57.0%),與AFP(74.0%)相當,敏感性最高的是DSA-AAG(85.4%),特異性最高的是AFP(84.8%)。見表8和圖3。

表8 DSA-AAG、AAG及AFP單項和聯(lián)合檢測模型LogitAAG1鑒別診斷HCC與非HCC的效能

采用Logistic回歸分析建立DSA-AAG、Alb和TB聯(lián)合檢測鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的模型為LogitAAG2=6.912×DSA-AAG-0.126×TB-0.193×Alb+6.417。ROC曲線分析結(jié)果顯示,DSA-AAG、AAG單項和聯(lián)合檢測模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的AUC分別為0.669、0.607、0.929,LogitAAG2的診斷效能優(yōu)于DSA-AAG和AAG單項檢測。見表9和圖3。

表9 DSA-AAG、AAG單項和聯(lián)合檢測模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的效能

圖3 各項指標單項及聯(lián)合檢測診斷HCC的ROC曲線

3 討論

糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,血清中有50%~70%的蛋白為糖基化修飾蛋白[19]。糖基化修飾在很多關鍵的生物學過程中起重要作用,如細胞的生長、分化、黏附以及分子運輸和清除、受體激活、信號轉(zhuǎn)導、內(nèi)吞作用等,對維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及其生物學功能同樣起著重要作用,同時還直接參與疾病的病理生理過程[20]。肝臟是體內(nèi)除B細胞外最重要的糖基化修飾部位[21]。AAG是由肝細胞合成并分泌的急性時相反應蛋白,其糖基化改變與肝臟疾病具有密切關聯(lián)。DSA-AAG代表的是血清中能與DSA特異性結(jié)合的AAG,即含有多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的AAG。

目前,臨床上常用的腫瘤標志物大部分為糖蛋白,如AFP、CEA、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)、CA19-9、CA125等。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中,糖蛋白會出現(xiàn)異常糖基化修飾[22],因此異常糖基化腫瘤標志物也成為新的研究熱點。大多數(shù)經(jīng)異常糖基化修飾的蛋白質(zhì)位于細胞膜上或直接被分泌到血清中,血清中的聚糖結(jié)構(gòu)通常很穩(wěn)定,這使得將血清作為樣本檢測異常糖基化修飾蛋白成為可能。目前已有異常糖基化腫瘤標志物成功地應用于臨床:2005年,美國食品與藥品監(jiān)督管理局(U. S. Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)批準核心巖藻糖基化的AFP,即甲胎蛋白異質(zhì)體用于臨床。我國原發(fā)性肝細胞癌診療規(guī)范(2017版)也指出:血清AFP及其異質(zhì)體是診斷肝癌的重要指標和特異性最強的腫瘤標志物,常用于肝癌的普查、早期診斷、術后療效監(jiān)測和隨訪,且有助于鑒別腫瘤的來源[23]。因此,聚焦于異常糖基化改變?yōu)榘l(fā)現(xiàn)敏感性和特異性更高的腫瘤標志物提供了一個新的思路。

然而,由于聚糖結(jié)構(gòu)的高度復雜性,給異常糖基化蛋白質(zhì)的研究和臨床應用帶來了一定的困難。隨著高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)、毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)、質(zhì)譜(mass spectrometry、MS)等技術的應用,人們對聚糖結(jié)構(gòu)有了更全面的認識[24]。在尋找異常糖基化腫瘤標志物的過程中,凝集素發(fā)揮著重要的作用。凝集素是一類特殊的蛋白質(zhì)或糖蛋白,能識別特定糖鏈結(jié)構(gòu)并與之非共價、可逆地結(jié)合。許多凝集素,尤其是植物凝集素,成為糖復合物研究中的重要工具[22]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)省去了分離和富集單個蛋白的繁瑣步驟,方法簡便、敏感、易于標準化,可實現(xiàn)大批量樣本的檢測。DSA能特異性識別多天線糖鏈結(jié)構(gòu)。通過基于DNA測序儀的熒光糖電泳技術對IgG的N-糖鏈結(jié)構(gòu)圖譜進行研究,結(jié)果顯示IgG分子不含多天線糖鏈結(jié)構(gòu)[25]。因此將DSA與ELISA聯(lián)用建立的Lectin-ELISA方法可避免抗體分子自身糖鏈結(jié)構(gòu)對檢測的干擾,又具有常規(guī)ELISA的特點。

本研究構(gòu)建了檢測血清DSA-AAG的Lectin-ELISA,并對該方法的檢測性能進行了初步評價。由于目前尚無關于正常人血清多天線糖鏈結(jié)構(gòu)AAG水平的相關報道,同時也缺乏相關的標準品,因此本研究以健康人混合血清替代標準品進行檢測。為盡量減少檢測過程中非特異性結(jié)合對結(jié)果產(chǎn)生的干擾,在預實驗中,本研究嘗試了多種血清稀釋液,結(jié)果顯示LowCrossbuffer對降低本底和非特異性干擾的效果比其他稀釋液更明顯,因此采用LowCross-buffer作為血清樣本稀釋液。同時設置空白對照,計算時扣除本底,以此來減少非特異性結(jié)合的干擾。有研究結(jié)果顯示,HCC患者血清AAG巖藻糖基化和唾液酸水平升高[16,26]。本研究結(jié)果顯示,HCC患者血清DSA-AAG水平高于疾病對照組和正常對照組(P<0.001),癌癥組血清DSA-AAG水平高于非癌癥組(P<0.001)。因此,AAG多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的改變與肝癌的發(fā)生可能具有潛在聯(lián)系。HCC患者血清DSA-AAG水平高于ICC患者(P<0.001),提示DSA-AAG的產(chǎn)生可能與腫瘤細胞的來源也具有一定的關系。MEHTA等[27]的研究結(jié)果顯示,肝癌組織中DSA結(jié)合的三、四天線結(jié)構(gòu)的糖鏈水平顯著高于癌旁組織(P<0.001)。本研究結(jié)果還顯示,不同腫瘤大小和分期的HCC患者之間血清DSA-AAG水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此,DSAAAG可能與腫瘤的進展、侵襲等生物學行為無關。ROC曲線分析結(jié)果顯示,DSA-AAG、AAG和AFP的聯(lián)合檢測模型LogitAAG1對鑒別診斷HCC與非HCC具有較高的價值。本研究中AFP陰性的HCC患者占HCC患者的40.9%。目前,AFP陰性的HCC患者尚缺乏可靠的實驗室診斷指標。本研究結(jié)果顯示,AFP陰性HCC組血清DSAAAG水平顯著高于非癌癥組(P<0.001),DSAAAG、Alb與TB的聯(lián)合檢測模型LogitAAG2鑒別診斷AFP陰性HCC與非HCC的AUC達0.929,這為AFP陰性HCC的鑒別診斷提供了一個較好的血清學診斷指標。

本研究采用Lectin-ELISA檢測血清DSAAAG水平,結(jié)果顯示HCC患者血清DSA-AAG水平顯著升高,與本實驗室前期基于DNA測序儀的熒光糖電泳得到的HCC患者血清N-糖鏈結(jié)構(gòu)圖譜一致,圖譜中代表多天線糖鏈結(jié)構(gòu)的峰值顯著升高[25]。HCC患者血清多天線糖蛋白水平升高可能與肝癌組織中合成多天線結(jié)構(gòu)相關的糖基轉(zhuǎn)移酶升高,導致肝癌細胞分泌的蛋白糖鏈分枝增加有關[28],其具體機制還有待進一步研究。

綜上所述,DSA-AAG及聯(lián)合檢測模型對HCC以及AFP陰性HCC的鑒別診斷可能有一定價值。但現(xiàn)階段的研究缺乏獨立驗證及跟蹤隨訪數(shù)據(jù),因此尚不能評估以上指標在治療前、后的變化情況及在預后判斷中的價值。此外,由于標準品的缺乏,現(xiàn)階段暫時難以進行Lectin-ELISA靈敏度及準確性的相關研究,這也是Lectin-ELISA的局限所在,因此該方法還有很大的改善空間。后續(xù)將依托上海東方肝膽外科醫(yī)院多中心分子診斷合作平臺進一步收集各期HCC患者術后的血清樣本,完善跟蹤隨訪數(shù)據(jù),并進行多中心驗證,為后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化和應用奠定基礎。

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