歐維正, 秦 萬, 王 瓊, 王明棟, 張 娟, 徐 勇, 張廷梅
(貴陽市公共衛(wèi)生救治中心,貴州 貴陽 550003)
結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的最嚴重的肺外結(jié)核病,占所有肺外結(jié)核病的5%~10%[1],發(fā)病率高,病死率可達15%~30%[2]。目前,診斷TBM主要依據(jù)臨床癥狀和腦脊液檢測,其中病原學(xué)檢測是診斷的金標準。腦脊液樣本中MTB載量低,導(dǎo)致抗酸染色法敏感性差,且不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous Mycobacterium,NTM);培養(yǎng)法雖然結(jié)果精確、可靠,但培養(yǎng)周期為6~8周,易延誤治療。MTB核酸檢測技術(shù)分為2類:一類是以RNA擴增為基礎(chǔ)、以DNA為檢測靶標的核酸檢測技術(shù),如熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),目前國內(nèi)外商品化的MTB核酸檢測試劑多基于此類技術(shù);一類是以RNA擴增為基礎(chǔ)、以為檢測靶標的核酸檢測技術(shù),如恒溫擴增實時熒光檢測(simultaneous amplification and testing,SAT)。MTB核酸檢測技術(shù)敏感性高、速度快,目前已被廣泛應(yīng)用于臨床。本研究通過比較培養(yǎng)法、PCR和SAT檢測腦脊液樣本中MTB的效能,評價SAT在TBM診斷中的應(yīng)用價值。
選取2017年6月—2018年9月貴陽市公共衛(wèi)生救治中心疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者496例,其中328例最終臨床診斷為TBM(TBM組)[男197例、女131例,年齡(33.5±18.7)歲];另外168例經(jīng)臨床鑒別診斷排除TBM(對照組)[男100例、女68例,年齡(40.8±20.5)歲]。
ABI 7300實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、Extractor 36核酸快速提取儀(北京博奧生物有限公司)、TL988實時熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)、FZP-1核酸提純儀(上海仁度生物科技有限公司)、K30干式恒溫器(上海之信儀器有限公司)等;羅氏固體培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸(p-Nitrobenzoic acid,PNB)培養(yǎng)基(珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司)、分枝桿菌核酸檢測(PCR-熒光探針法)試劑盒(北京博奧生物有限公司)、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(RNA恒溫擴增法)試劑盒(上海仁度生物科技有限公司)。
采集所有患者腦脊液樣本約6 mL,分2管送檢,1管(約2 mL)用于細菌培養(yǎng),1管(約4 mL)用于PCR和SAT。
1.3.1 細菌培養(yǎng) 將腦脊液樣本直接接種于羅氏固體培養(yǎng)基上,若滿8周仍無細菌生長,即報告培養(yǎng)陰性。分離到的菌株參照文獻[3]進行PNB試驗,如菌株在PNB培養(yǎng)基上生長,則鑒定為NTM,反之鑒定為MTB。
1.3.2 PCR 將約2 mL腦脊液樣本按工作手冊[4]進行PCR。樣本MTB擴增曲線呈S型,且循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)<36判定為MTB-DNA陽性;樣本NTM擴增曲線呈S型,且Ct值<40判定為NTM-DNA陽性;MTB-DNA和NTM-DNA均為陽性時,判為MTB-DNA陽性;MTB-DNA和NTM-DNA均為陰性時,判為無分枝桿菌檢出。以試劑盒自帶的陰性、陽性對照作為質(zhì)控。
1.3.3 SAT 將約1.5 mL腦脊液樣本加入1.5 mL離心管中,14 170×g離心5 min,棄上清;加入50 μL MTB-RNA稀釋液,充分震蕩后懸浮,制成待測樣本。將待測樣本和50 μL陰性對照放入FZP-1核酸提純儀內(nèi)(液體要浸在水面以下),超聲處理15 min后取出,再14 170×g離心5 min,上清即為提取的RNA。取2 μL提取好的RNA加入含30 μL擴增檢測液的潔凈微量反應(yīng)管中,于K30干式恒溫器內(nèi)60 ℃放置10 min,再42 ℃放置5 min,之后保持在42 ℃,加入10 μL SAT酶;采用TL988實時熒光定量PCR儀進行擴增(42 ℃ 1 min,40個循環(huán),每分鐘采1次熒光,選取FAM通道)。結(jié)果判斷:Ct值<40判定為MTB-RNA陽性,Ct值≥40判定為MTBRNA陰性。以試劑盒自帶的陰、陽性對照作為質(zhì)控。
采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例或率表示,組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
496例腦脊液樣本中,培養(yǎng)法分離到37株(7.46%)菌株,經(jīng)PNB試驗鑒定均為MTB。PCR檢測檢出MTB-DNA陽性22例(4.44%),SAT檢出MTB-RNA陽性51例(10.28%)。見表1。
表1 TBM組與對照組3種方法檢測結(jié)果 例
SAT檢測MTB的敏感性最高(15.24%),與培養(yǎng)法比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.24,P>0.05);與RCR比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.23,P<0.05)。培養(yǎng)法和PCR檢測MTB的特異性均為100%,但與SAT(特異性為99.40%)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.00,P>0.05)。見表2。
表2 3種方法MTB檢測效能
T B M組3 2 8例腦脊液樣本中,7 7例(23.48%)檢測到MTB。以培養(yǎng)法為標準,SAT的符合率為82.01%,敏感性為37.84%,特異性為87.6%。PCR的符合率為86.89%、敏感性為21.62%、特異性為95.19%。見表3。
表3 TBM組3種方法MTB檢測結(jié)果比較
TBM屬于重癥結(jié)核病,是結(jié)核病患者死亡的主要原因之一。對TBM患者進行早期診斷、規(guī)范治療,可顯著降低其致殘率、致死率[5]。由于TBM患者病情輕重程度不同、就診階段不同、臨床表現(xiàn)多樣,加之腦脊液實驗室檢查特征性結(jié)果較少,導(dǎo)致確診TBM的難度較大,但檢出腦脊液樣本中的MTB仍然是確診TBM的金標準。
SAT方法是基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(transcription mediated amplification,TMA)和恒溫擴增技術(shù)發(fā)展起來的一項新的核酸檢測技術(shù),其原理是通過設(shè)計特異性的MTB核糖體RNA擴增引物及優(yōu)化探針技術(shù),使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及極高轉(zhuǎn)錄活性的T7 RNA多聚酶同時實現(xiàn)核酸恒溫擴增和實時熒光檢測,能夠快速、直觀地反映樣本中有無MTB。與傳統(tǒng)的基于DNA模板的核酸擴增技術(shù)相比,其優(yōu)點為[6]:(1)對儀器的要求低,操作簡便,穩(wěn)定性和結(jié)果準確性高;(2)起始靶標為環(huán)境中極易降解的RNA,可有效避免污染;(3)因RNA只在活菌中存在,SAT還可監(jiān)測疾病活動性及藥物療效;(4)RNA拷貝數(shù)比DNA的拷貝數(shù)高,并且熒光標記的RNA探針可同步檢測擴增信號,提高檢測敏感性。
本研究采用培養(yǎng)法、PCR和SAT對腦脊液樣本進行同步檢測,比較3種方法檢測結(jié)果,以評估SAT快速檢測腦脊液樣本中MTB的效能,結(jié)果顯示,以臨床診斷TBM作為標準,SAT檢測MTB的敏感性為15.24%,與培養(yǎng)法(11.28%)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與PCR(6.71%)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與張海晴等[7]的研究結(jié)果一致。目前,關(guān)于SAT檢測腦脊液樣本的研究較少,而對其檢測痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液等樣本的研究[8-9]較多,結(jié)果均顯示SAT對這些樣本中的MTB有較高的檢測敏感性,并優(yōu)于培養(yǎng)法。本研究采用的3種方法在操作上均無需對腦脊液樣本進行前處理,保證了3種方法檢測前樣本的一致性,增加了檢測結(jié)果的可比性。但因腦脊液載菌量低、取樣量少,抗結(jié)核藥物治療后腦脊液細菌負荷量迅速下降[10]等因素,往往導(dǎo)致MTB檢測敏感性不高。2009年,英國感染學(xué)會建議TBM患者在抗結(jié)核藥物治療前留取不少于6 mL的腦脊液進行細菌學(xué)檢查,并且在檢測前將腦脊液樣本3 000×g離心至少20 min[11]。
本研究結(jié)果顯示,SAT檢測MTB的特異性為99.40%,略低于培養(yǎng)法和PCR(100%),但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。SAT和PCR同屬于分子生物學(xué)檢測方法,控制實驗室污染是檢測成功的關(guān)鍵。2000年,BARAN等[12]指出,SAT雖然具有一定的檢測效率,但仍然存在一定的假陽性率與假陰性率。盡管SAT檢測的RNA易降解,但操作不當仍然可能會造成污染。本研究SAT檢測出現(xiàn)1例假陽性,提示該技術(shù)在操作過程中應(yīng)嚴格遵守各項規(guī)范,避免人為因素降低其檢測效能。
本研究結(jié)果表明,培養(yǎng)法MTB陽性檢出率與SAT差異無統(tǒng)計學(xué)意義,與PCR差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SAT對腦脊液MTB的檢測效果更接近培養(yǎng)法,優(yōu)于PCR和SAT,有明顯的快檢優(yōu)勢。
RNA降解快,如果患者的腦脊液含菌量不多,而SAT操作時間控制不當,如放在核酸提純儀中超聲處理留置時間過長,也可能會造成SAT對MTB的檢出率下降[13];另外,若樣本中或容器內(nèi)存在核酸擴增抑制劑,檢測出現(xiàn)假陰性的可能性會增加[14]。這些均可能導(dǎo)致部分結(jié)果培養(yǎng)法為陽性,而SAT檢測陰性。
本研究結(jié)果表明,3種方法腦脊液MTB陽性總檢出率為23.48%,優(yōu)于單一使用任一方法。目前,尚無一種可快速、準確地診斷結(jié)核病的方法,采用SAT、PCR等快速分子診斷技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法,不僅可以提高診斷率,還可以縮短診斷周期,為臨床對結(jié)核病的診治提供更準確、更快速的依據(jù)。
綜上所述,SAT能快速檢測腦脊液中的MTB,敏感性較高,可用于對TBM患者進行早期診斷。3種方法聯(lián)合檢測可提高腦脊液MTB的陽性檢出率。