丁趁趁，梁 芳，梁 榮，霍清萍

腦血管病是世界上主要致死性疾病之一[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是所有腦血管意外事件發(fā)生的病理基礎(chǔ)，是以脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤為特征的慢性炎癥性疾病。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與動脈粥樣硬化病變有關(guān)[2]， Kappa B 抑制蛋白(inhibitory kappa B，IκB)是NF-κB的主要調(diào)控抑制劑。穩(wěn)消方由地龍、水蛭、牡丹皮、郁金、丹參、半夏6味中藥組成，具有活血化瘀、行氣通絡(luò)、化痰利濕之功效，前期動物研究表明，穩(wěn)消方可降低動脈粥樣硬化模型兔的血脂指標(biāo)，調(diào)節(jié)血脂代謝；抑制炎性因子及纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)的表達(dá)[3-6]。臨床研究證實(shí)，穩(wěn)消方可改善血脂代謝、減少炎性因子的表達(dá)及降低血黏度、踝臂指數(shù)、動脈內(nèi)-中膜厚度[7-13]。NF-κB是過氧化物酶體增殖物受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)激動劑的重要靶分子，在炎癥反應(yīng)基因的活化中作用突出。PPARγ通過調(diào)控NF-κB表達(dá)來抑制細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等炎性因子表達(dá)和炎癥反應(yīng)，從而影響動脈粥樣硬化形成[14]。前期動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，穩(wěn)消方可激活PPARγ信號通路，上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB p65水平表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，具有穩(wěn)定斑塊的作用[15]。IκB是NF-κB的主要調(diào)控抑制蛋白，IκB的生成和降解與NF-κB的活化密切相關(guān)，IκB可通過抑制NF-κB炎癥途徑的激活減少血管損傷和內(nèi)皮細(xì)胞活化，抑制炎性因子的表達(dá)[16]。本研究通過高脂飼料建立實(shí)驗(yàn)兔腹主動脈粥樣硬化模型，觀察Kappa B 抑制蛋白α(IκBα)與NF-κB蛋白表達(dá)水平，探討穩(wěn)消方改善實(shí)驗(yàn)兔動脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取清潔級新西蘭大白兔38只，雌雄各半，月齡3～4個月，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，購自上海松江車墩實(shí)驗(yàn)動物良種廠[許可證號：SCXK(滬)2017-0011]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物房相對濕度為50%，室溫維持在20～24 ℃，每日光照時間為07：00～18：00，飼養(yǎng)條件為2級。

1.2 藥品和試劑 高脂飼料：普通食料91%、蛋黃粉5%、豬油3%、膽固醇1%，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心代訂購。穩(wěn)消方免煎顆粒：地龍、水蛭、牡丹皮、郁金、丹參、半夏按3∶3∶3∶3∶3∶2比例配伍而成，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：1709066。辛伐他汀：商品名舒降之，默沙東公司提供，生產(chǎn)批號：J20130068。

抗體：Ⅰ抗IκBα(美國Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)，批號17548)，NF-κB p65(上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號082418180824)，β-actin(英國Abcam公司生產(chǎn)，批號GR70927-6)；Ⅱ抗：山羊抗兔HRG抗體，山羊抗小鼠HRG抗體，兔二步法檢測試劑盒，小鼠二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物公司生產(chǎn)，批號分別為109534、109147、K185209A、K184312A)。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒，BeyoECL Moon 特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，PVP封片液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號分別為082917180312、091317170911、101617171013、081617170911)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號K187721A)；總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號P1033)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號20314)。

1.3 儀器 VARIOSKAN FLASH 酶標(biāo)儀、PLUS新型-86 ℃超低溫冰箱購自美國Thermo Scientific Revco公司，Haier醫(yī)用冷藏箱購自青島海爾特種電器有限公司，DP73+standard 1.6型顯微鏡攝像CCD照相系統(tǒng)購自日本Olympus公司，Power PAC Basic 電泳儀、chemidocTM XRS+with imagelabTM software型凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，RH BASIC S25加熱磁力攪拌器購自德國IKA儀器設(shè)備有限公司，Leica RM2016切片機(jī)購自德國徠卡公司，PPJ-A型漂片機(jī)購自常州市中威電子儀器有限公司，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組、造模 將38只清潔級新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白組(9只)和造模組(29只)，每只實(shí)驗(yàn)兔每日分別給予150 g標(biāo)準(zhǔn)飼料和100 g高脂飼料喂養(yǎng)，其余由標(biāo)準(zhǔn)飼料補(bǔ)足，所有動物均單籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂養(yǎng)12周。

1.4.2 藥物干預(yù) 造模成功后，采用隨機(jī)分組法[17]將造模組隨機(jī)分為模型組、穩(wěn)消方組和辛伐他汀組，每組9只，全部實(shí)驗(yàn)兔以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，根據(jù)人與動物用藥比例進(jìn)行折算[18]，計(jì)算實(shí)驗(yàn)兔用量，穩(wěn)消方中半夏383.33 mg/kg，地龍、水蛭、牡丹皮、郁金、丹參各575 mg/kg；辛伐他汀0.77 mg/kg，用蒸餾水溶解，混勻后灌胃；模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg。灌胃治療8周后取材。

1.4.3 取材 實(shí)驗(yàn)第20周取材，于取材前夜禁水、禁食12 h，新西蘭大白兔以戊巴比妥鈉1.3 mL/kg麻醉后，仰臥位固定，腹主動脈采血處死，無菌條件下，順血管走向，仔細(xì)分離血管周圍的結(jié)締組織，以左右髂動脈分叉為參照，在腹主動脈至髂總動脈分叉處向上留2 cm剪取血管。用氯化鈉溶液將標(biāo)本沖洗后，迅速取出一側(cè)腹主動脈置于4%多聚甲醛固定，進(jìn)行病理檢查，另一側(cè)腹主動脈放入液氮迅速冷凍，隨后于-80 ℃冰箱凍存，進(jìn)行相關(guān)蛋白檢測。

1.4.4 腹主動脈病理學(xué)檢查 組織經(jīng)常規(guī)脫水透明和石蠟包埋后，以4 μm厚度切片，60 ℃烘片2 h，新鮮二甲苯脫蠟3次，每次25 min，梯度乙醇(100%、90%、85%、70%)水化，每次10 min，蒸餾水浸泡沖洗2 min。洗耳球吹去多余水分，蘇木精染色液著色4 min，浸自來水10 min，洗去多余染色液。浸蒸餾水5 s，95%乙醇5 s，伊紅染色液著色3 min。70%乙醇脫水2次，每次5 min，95%乙醇脫水2次，每次5 min，新鮮二甲苯透明2次，每次10 min。取出切片，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，以PVP封片液封片，留待鏡檢。

1.4.5 免疫組化法(IHC)檢測 石蠟切片常規(guī)脫臘，乙醇梯度水化后，將樣本玻片浸沒于枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH6.0)中，微波爐高火4次，每次5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)；0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗3次，每次5 min；0.3%Triton破膜，37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS漂洗同前，加入適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育20 min；蒸餾水浸洗1 min，0.01 mol/L PBS漂洗如前；根據(jù)組織大小，滴加適量碧云天QuickBlockTM封閉液，室溫封閉20 min；滴加一抗IκBα(1∶100)、NF-κBp65(1∶50)，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜；室溫復(fù)溫1 h，橡膠洗耳球吹去多余液體，滴加適量增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS漂洗如前；加入適量新鮮配制的DAB顯色液，暗室室溫孵育6 min；自來水浸洗1 min，蒸餾水浸洗2次，每次1 min；蘇木精染色液著色4 min，浸自來水10 min，洗去多余染色液。浸蒸餾水5 s，如前法行常規(guī)透明封片。

1.4.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Bolt)檢測 超高速離心機(jī)低溫預(yù)設(shè)4 ℃，按照每100 mg組織加入0.5 mL裂解液開始勻漿，混懸搖勻，離心機(jī)內(nèi)靜置10 min，每0.5 mL裂解液加1 mL抽提試劑，混懸搖勻，離心機(jī)內(nèi)靜置10 min，以離心力10 000 g 離心10 min，溶液分為上下兩相，中間為蛋白膜。小心吸棄上下層液體，蛋白膜4 ℃靜置干燥。2%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶解蛋白膜，BCA法蛋白定量。蛋白溶液和4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)以4∶1混勻后100 ℃水浴變性10 min。每孔等量加入15 μg樣本蛋白溶液，80 V電壓開始SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，各上樣孔溴酚藍(lán)指示劑行至濃縮膠和分離膠交界而呈一水平直線，調(diào)至120 V電壓，至溴酚藍(lán)指示劑位于膠版底部即終止電泳。加入4 ℃預(yù)冷的1×半干轉(zhuǎn)緩沖液，70 V轉(zhuǎn)膜2 h，取出蛋白膜，1×TBST漂洗3次，每次5 min，加入碧云天QuickBlockTM封閉液，室溫封閉25 min；滴加一抗IκB α(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)和β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；室溫復(fù)溫1 h，滴加山羊抗兔HRG抗體、山羊抗小鼠HRG抗體(均為1∶5 000)，室溫?fù)u床孵育1 h。1×TBST漂洗同前，滴加適量碧云天BeyoECL Moon極超敏ECL工作液并使其均勻覆蓋在蛋白膜上，靜置1 min，吸棄BeyoECL Moon工作液，暗室顯影，Bio-Rad凝膠成像儀拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1 腹主動脈組織形態(tài) HE染色鏡下可見，細(xì)胞核藍(lán)染，胞漿呈粉紅色或紅色?？瞻捉M顯示正常動脈結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜光滑完整，血管膜層分界清楚，平滑肌細(xì)胞排列整齊，主動脈內(nèi)膜未見增厚，無斑塊形成。模型組內(nèi)皮細(xì)胞增生，內(nèi)膜變厚，脂質(zhì)堆積，泡沫細(xì)胞積聚，平滑肌細(xì)胞排列不規(guī)則，血管壁上動脈粥樣硬化斑塊大量形成。與模型組比較，穩(wěn)消方組和辛伐他汀組主動脈內(nèi)膜相對光滑完整，未見明顯增生，僅可見少量斑塊。詳見圖1。

圖1 各組腹主動脈組織形態(tài)比較(HE，×100)

2.2 免疫組化檢測腹主動脈IκBα和NF-κB蛋白表達(dá) IκBα和NF-κB的表達(dá)主要位于斑塊中，模型組與空白組比較，IκBα和NF-κB在斑塊中的表達(dá)均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。穩(wěn)消方組、辛伐他汀組與模型組比較，IκBα蛋白表達(dá)增加，NF-κB蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖2、表1。

圖2 免疫組化檢測腹主動脈IκBα和NF-κB蛋白表達(dá)(IHC，×200)

表1 免疫組法各組腹主動脈IκBα和NF-κB蛋白表達(dá)比較(±s)

2.3 Western Bolt法檢測腹主動脈IκBα和NF-κB蛋白表達(dá) 模型組與空白組比較，IκBα和NF-κB蛋白表達(dá)均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。穩(wěn)消方組與模型組比較，IκBα蛋白表達(dá)增加，NF-κB蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。辛伐他汀組與模型組比較，IκBα蛋白表達(dá)增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NF-κB蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖3、表2。

A為空白組；B為模型組；C為穩(wěn)消方組；D為辛伐他汀組。

表2 Western Bolt法各組腹主動脈IκBα和NF-κB蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

高脂飼料飼養(yǎng)是最常用的建模方法，兔是草食性動物，對高脂飲食極為敏感，短期內(nèi)即可完成動脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)兔的造模，并且動脈粥樣硬化模型兔局部動脈的病理特征與人動脈粥樣硬化的病理特征相似。藥物干預(yù)后，進(jìn)行HE染色，觀察各組病理組織形態(tài)，空白組可見內(nèi)膜光滑完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，模型組可見主動脈內(nèi)膜區(qū)域發(fā)生明顯增厚，動脈粥樣硬化斑塊形成，內(nèi)見泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞排列不規(guī)則，穩(wěn)消方組及辛伐他汀組可見少量斑塊。與模型組比較，穩(wěn)消方組及辛伐他汀組斑塊較小，對于穩(wěn)消方是否能夠減小斑塊的大小，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步研究。但從HE染色的結(jié)果看，穩(wěn)消方組和辛伐他汀組的斑塊大小明顯小于模型組。

炎癥反應(yīng)貫穿動脈粥樣硬化的全過程，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是炎癥、免疫應(yīng)答和細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。IκB是NF-κB的調(diào)控抑制劑，在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與IκB蛋白復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中。NF-κB激活主要通過IκBα的降解實(shí)現(xiàn)，IκB激酶(IKK)是NF-κB活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)激酶[19]，NF-κB活化的關(guān)鍵步驟是IKK復(fù)合物對IκB蛋白的磷酸化[20]。由于受到炎癥信號刺激，IκB蛋白在IκB激酶的作用下發(fā)生磷酸化，使蛋白酶體發(fā)生降解，NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在κB位點(diǎn)上與基因啟動子中的元件特異性結(jié)合，誘導(dǎo)促炎性因子的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中檢測到活化的NF-κB[21]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，IκBα和NF-κB的表達(dá)主要位于斑塊中，模型組與空白組比較，IκBα和NF-κB在斑塊中的表達(dá)均明顯增加。穩(wěn)消方組與模型組比較，IκBα蛋白表達(dá)明顯增加，NF-κB蛋白表達(dá)明顯減少。

IκB是NF-κB的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑，許多參與致動脈粥樣硬化事件的促炎性因子的表達(dá)直接受NF-κB調(diào)控，研究表明IκBα的過表達(dá)可有效抑制NF-κB的激活從而減少內(nèi)膜增生和平滑肌細(xì)胞增殖，抑制動脈粥樣硬化斑塊細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[22-23]，研究發(fā)現(xiàn)在IκBα缺乏的小鼠血管壁中出現(xiàn)巨噬細(xì)胞聚集增加的現(xiàn)象[24]。IκB的基因轉(zhuǎn)移可能潛在地抑制NF-κB途徑，IκB蛋白通過阻斷NF-κB的激活，可以抑制白細(xì)胞介素(IL)-6炎癥介質(zhì)的表達(dá)[25]。Western Bolt檢測結(jié)果顯示，穩(wěn)消方組與模型組比較，IκBα蛋白表達(dá)明顯增加，NF-κB蛋白表達(dá)明顯減少。辛伐他汀組與模型組比較，IκBα蛋白表達(dá)未見明顯增加，NF-κB蛋白表達(dá)明顯減少。提示穩(wěn)消方可能通過增加IκBα蛋白水平，抑制NF-κB活化，抑制炎性因子的過表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，對穩(wěn)定斑塊、抑制動脈粥樣硬化具有一定作用。