張秀英

江蘇省常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州213001

慢性乙肝肝炎在我國(guó)發(fā)病率較高，與我國(guó)的飲食和生活習(xí)慣存在一定聯(lián)系，患者感染乙肝病毒后，出現(xiàn)慢性肝病、肝硬化以及肝細(xì)胞癌，對(duì)生命健康造成非常嚴(yán)重的威脅。干擾素是目前治療慢性乙肝中效果較好的藥物，療效方面得到肯定，不良反應(yīng)較小，在臨床中應(yīng)用率較高。但是乙肝病毒屬于一種高變異性的病毒，HBV在體內(nèi)主要以準(zhǔn)種的形式存在和分布，并且隨著人體類(lèi)核苷酸類(lèi)藥物的長(zhǎng)期使用，耐藥性進(jìn)一步增加，因此在進(jìn)行治療的過(guò)程中如何有效避免具有耐藥性的準(zhǔn)株繁殖成為目前治療慢性乙肝需要關(guān)注的問(wèn)題，科學(xué)地進(jìn)行耐藥性的干預(yù)，可以減少不規(guī)范藥物使用造成的治療失敗等情況，全面提升疾病的治療質(zhì)量，對(duì)疾病進(jìn)行更加科學(xué)規(guī)范的治療[1]。該文對(duì)2016年1月—2018年12月期間60例慢性乙肝患者不規(guī)范使用核苷(酸)類(lèi)似物抗病毒治療的HBV耐藥基因突變情況進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60例慢性乙肝患者均在該院接受治療，納入指標(biāo)：①符合國(guó)家肝病學(xué)以及感染病對(duì)慢性乙肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)，具有不規(guī)范使用核苷酸類(lèi)治療藥物的歷史，在藥物使用之后存在各項(xiàng)不良反應(yīng)，治療的依從性較差，不愿接受長(zhǎng)期服藥治療，但是尚未達(dá)到指標(biāo)規(guī)定的治療效果；②未咨詢醫(yī)生情況下，自行更換治療藥物或方案；③接受抗病毒治療后無(wú)法遵醫(yī)要求回院接受檢查，對(duì)于疾病的各項(xiàng)情況了解不清晰；④自行延長(zhǎng)藥物服用間隔時(shí)間，經(jīng)常漏用藥物，藥物使用不規(guī)范。排除指標(biāo)：①實(shí)施規(guī)律性的服藥，并進(jìn)行定期的隨訪工作，待各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)至正常水平之后停藥；②完全依從并遵醫(yī)囑接受治療，按時(shí)復(fù)院檢查，發(fā)現(xiàn)無(wú)應(yīng)答或病毒性突破；③治療無(wú)不規(guī)范情況，并且檢查中未發(fā)生病毒反彈、疾病復(fù)發(fā)的情況[2]?；颊咧?，男性44例，女性16例；年齡處于21～67歲之間，平均年齡為（44.85±32.46）歲。該實(shí)驗(yàn)實(shí)施之前已經(jīng)得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的論證，患者也了解實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)內(nèi)容，并簽署了同意書(shū)。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)前詳細(xì)查看護(hù)士做的護(hù)理記錄表，了解患者情況、用藥病史和現(xiàn)狀，查看患者肝功能生化檢驗(yàn)指標(biāo)，并獲取患者完整的臨床就診記錄，采集預(yù)后轉(zhuǎn)歸之后的詳細(xì)信息。

實(shí)驗(yàn)采用抽取靜脈血的方式獲取樣本資料，血液樣本采集前8 h禁食禁飲，于清晨時(shí)間段采集靜脈血5 mL，離心后提取血清，將其放置于-20℃環(huán)境中進(jìn)行存儲(chǔ)，并使用PCR反向點(diǎn)雜交法對(duì)乙肝病毒的耐藥變異和基因類(lèi)型進(jìn)行測(cè)試，與患者臨床資料中藥物使用歷史、藥物使用方法等基本資料進(jìn)行對(duì)比分析，確定患者病毒P區(qū)基因序列突變率以及突變的形式[3]。

檢測(cè)中首先對(duì)HBV DNA進(jìn)行提取，在1.5 mL離心管中加入200μL HBV DNA提取液1 200μL待檢血清，混合后震蕩使其均勻，之后使用13 000 rpm進(jìn)行離心，時(shí)間為5 min，將上清液廢棄，加入50μL HBV DNA提取液2，充分震蕩混合，于水沸騰點(diǎn)紅甌下脫干，10 min后將三氯甲烷5μL加入其中，于離心率為12 000 rpm轉(zhuǎn)下離心5 min，將配置好的PCR反應(yīng)體系加入1.50μL DNA，使總反應(yīng)體積增加至25μL[4]；進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)合實(shí)際溫度不同選擇適宜的反應(yīng)時(shí)間，如在50℃環(huán)境下變性，時(shí)間控制在2 min，在95℃環(huán)境下進(jìn)行預(yù)變性，時(shí)間則為10 min，如在94℃環(huán)境下變性時(shí)間可控制在60 s，需在實(shí)驗(yàn)中對(duì)指標(biāo)進(jìn)行更加科學(xué)的控制；經(jīng)過(guò)95℃變性之后，實(shí)施雜交，將樣本與25μL反應(yīng)物進(jìn)行混合，放置于雜交試劑盒A液中，在47℃環(huán)境下雜交1.5 h，后進(jìn)行洗膜與顯色，在預(yù)熱47℃預(yù)熱B液進(jìn)行洗滌，時(shí)間為20 min，并進(jìn)行避光顯色，時(shí)間30 min[5]。

1.3 觀察指標(biāo)

①分析突變形式以及突變率。突變形式包括M2041、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V。②分析不同基因型突變率，基因型包括B型、C型、BC混合型以及非BC混合型。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析突變形式以及突變率

突變率分析，總發(fā)生率為70.00%，比例較高，而不同突變形式分析，發(fā)現(xiàn)主要突變形式為M2041、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V，發(fā)生率分別為16.67%、18.33%、21.67%、13.33%，見(jiàn)表1。

表1 分析突變形式以及突變率Table 1 Analysis of mutation form and mutation rate

2.2 分析不同基因型突變率

分析不同基因型突變率，發(fā)現(xiàn)B型占據(jù)比例最高，為59.52%，其次為C型，19.05%，BC混合型發(fā)生率最低，僅為7.14%，見(jiàn)表2。

表2 分析不同基因型突變率Table 2 Analysis of mutation rates of different genotypes

3 討論

慢性乙肝病毒的準(zhǔn)種突變序列分布較為穩(wěn)定，但是其在突變譜中的自我復(fù)制功能最強(qiáng)，可以將抗藥性突變序列轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢(shì)序列進(jìn)行再次復(fù)制，因此乙肝病毒屬于一種具有高變異性的病毒，在持續(xù)的感染中可以變異，并使人體出現(xiàn)免疫應(yīng)答，造成藥物的使用質(zhì)量受到影響，同時(shí)也會(huì)影響疫苗的使用效果。慢性乙肝患者在長(zhǎng)時(shí)間使用一種藥物之后，體內(nèi)的乙肝病毒準(zhǔn)種可發(fā)生突變，并將植株進(jìn)行大量的繁殖，造成植株的耐藥性增加[6]，治療難度增大，病情出現(xiàn)反復(fù)。因此在使用核苷(酸)類(lèi)似物抗病毒治療初期，應(yīng)選擇高耐藥基因屏障類(lèi)的藥物，可以提升疾病的治療質(zhì)量。而對(duì)于乙肝出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者，則需要對(duì)其發(fā)作階段的病毒準(zhǔn)種結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確定停藥復(fù)發(fā)的病毒株與藥物治療一致，選擇更加適宜治療的藥物，提升藥物的使用質(zhì)量[7]。特別對(duì)于一些藥物使用不規(guī)范的患者，自行停藥造成耐藥性增加，嚴(yán)重影響疾病恢復(fù)進(jìn)程。

上文中對(duì)突變率分析，發(fā)現(xiàn)總發(fā)生率為70.00%，比例較高，而不同突變形式分析，發(fā)現(xiàn)主要突變形式為M2041、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V，發(fā)生率分別為16.67%、18.33%、21.67%、13.33%，分析不同基因型突變率，發(fā)現(xiàn)B型占據(jù)比例最高，為59.52%，其次為C型，19.05%，BC混合型發(fā)生率最低，僅為7.14%。根據(jù)學(xué)者研究，選取98例中共檢測(cè)到62例(63.27%)發(fā)生耐藥相關(guān)基因突變,存在23種變異形式,最常見(jiàn)模式為M204I、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V；17例為多重耐藥突變；主要變異位點(diǎn)為M204V、M204I、L180M、N236T。耐藥藥物的使用與產(chǎn)生的耐藥位點(diǎn)基本一致,單用拉米夫定的突變率為70.97%,較單用阿德福韋酯及恩替卡韋高。C基因型組中多基因突變比例75.00%較B基因型組的34.29%高。停藥組的突變率為72.97%,明顯高于非停藥組33.33%，與該文研究結(jié)果存在一致性。分析原因：HBV的基因類(lèi)型存在顯著的地域性差異，我國(guó)北方主要以C型為主，而南方則主要以B型為主，因此在基因分型方面，存在不同的特征性差異，研究發(fā)現(xiàn)[8]HBV基因分型與P區(qū)耐藥突變模式存在關(guān)系，認(rèn)為C基因型耐藥檢出率高于B基因，因此可以初步分析HBV基因分型與耐藥性、乙肝進(jìn)程存在聯(lián)系；在進(jìn)行耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，因?yàn)楦鞣N原因治療依從性較差的患者較多，不規(guī)范使用抗病毒藥物的情況較為常見(jiàn)，如未能按照治療規(guī)范的需要停藥，可能導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)，甚至出現(xiàn)肝衰竭，核苷(酸)類(lèi)似物在使用過(guò)程中可以對(duì)HBV DNA多聚酶進(jìn)行抑制，但是僅能抑制乙肝病毒的復(fù)制，對(duì)于無(wú)法對(duì)cccDNA進(jìn)行作用，因此藥物治療過(guò)程中不能將乙肝病毒進(jìn)行清除，但是cccDNA的壽命幾乎可以與肝細(xì)胞達(dá)到一致，一旦其在干細(xì)胞核內(nèi)形成[9]，穩(wěn)定性較強(qiáng)，無(wú)法完全進(jìn)行清除，僅能依靠抗病毒藥物對(duì)其復(fù)制進(jìn)行抑制將其耗竭，因此規(guī)范化的藥物使用較為關(guān)鍵，可以在一定時(shí)間內(nèi)將肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA耗竭，保持治療質(zhì)量，如果在未得到e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)時(shí)而停止使用藥物，病毒則會(huì)馬上因?yàn)槭ニ幬锏囊种贫匦逻M(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致疾病突然加重，甚至出現(xiàn)肝衰竭，可見(jiàn)不規(guī)范使用核苷(酸)類(lèi)似物后果較為嚴(yán)重[10]；對(duì)突變形式以及突變率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LAM具有高耐藥基因屏障，其突變主要在逆轉(zhuǎn)錄酶基因C區(qū)中發(fā)生，堿基子在發(fā)生轉(zhuǎn)換時(shí)產(chǎn)生M2041，如繼續(xù)維持LAM治療，則出現(xiàn)耐藥性增強(qiáng)突變至L180M，同時(shí)出現(xiàn)多種組合耐藥性，例如L180M+M204V等[11]。ETV則是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷類(lèi)似物，其耐藥點(diǎn)位在L180M+M204V基礎(chǔ)上出現(xiàn)A區(qū)rtI169T等突變，但是發(fā)生率較低，對(duì)于初次治療患者幾乎不發(fā)生耐藥。因此突變類(lèi)型進(jìn)行分析需要結(jié)合HBV基因型、全基因序列以及患者的各項(xiàng)臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合分析，確定增加準(zhǔn)確的耐藥變異點(diǎn)位，提升疾病治療質(zhì)量[12-13]。

綜上所述，慢性乙肝患者在進(jìn)行疾病治療的過(guò)程中因?yàn)椴灰?guī)范使用核苷(酸)類(lèi)似物引發(fā)耐藥性，因此在疾病治療早期可進(jìn)行HBV耐藥基因突變測(cè)試，更加全面了解患者自身特征，規(guī)范使用核苷(酸)類(lèi)似物抗病毒治療，提升疾病治療質(zhì)量。