唐澄海

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院病理科，廣西桂林541002

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命安全[1]。由于HCC發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展到HCC的晚期，治療效果及預(yù)后較差。因此，亟需深入研究HCC的發(fā)病機(jī)制，了解HCC的發(fā)病機(jī)理，對(duì)于提高HCC的治療和預(yù)后具有重要意義?；虮磉_(dá)及調(diào)控紊亂是癌癥發(fā)生的基礎(chǔ)機(jī)制之一。早期的研究發(fā)現(xiàn)，殘疾基因同源物2（disabled homolog 2，DAB2）在多種癌癥組織中異常表達(dá)，包括肺癌[2]、宮頸癌[3]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[4]等。但是，目前關(guān)于DAB2在HCC中的研究尚未見報(bào)道。該研究2017年1月—2018年3月間于該院就診的51例HCC患者為研究對(duì)象，對(duì)患者肝癌及癌旁組織中的DAB2的表達(dá)及臨床關(guān)系進(jìn)行初步的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于該院就診的51例肝癌患者為研究對(duì)象，其中男28例，女23例；年齡29～78歲，平均年齡(55.00±12.96)歲。同時(shí)，收集患者的腫瘤分期、體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、分化程度、血管侵襲的信息及肝癌和癌旁的組織樣本，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。該研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)病理切片確認(rèn)為HCC；②患者年齡＞18周歲；③首次確診為HCC；④確診后未接受其他的放化療治療；⑤臨床資料完善且同意參與該研究計(jì)劃。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有其他腫瘤；②先天性的肝臟發(fā)育或功能不全；③合并患有其他傳染性疾?。虎芘R床資料不完善。

1.3 熒光定量PCR（RT-qPCR）

取0.05 g的組織樣品，采用TRIzol試劑提取組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA進(jìn)行定量。取0.5μg RNA為模板，采用Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，以cDNA為模板，在Bio-Rad C1000上進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃，30 s；40個(gè)循環(huán)的95℃，10 s，58℃，20 s。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析DAB2的相對(duì)表達(dá)水平。RT-qPCR的引物設(shè)計(jì)如下：DAB2，正向，5'-GTGTTCACGCAAGAACAGACAG-3'；反向，5'-TGCTGACTTCAGGAGAAGGGT-3'；和β-actin，正向，5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'；反 向，5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'。

1.4 Western blotting

取0.05 g的組織樣品，采用RIPA裂解液裂解組織后，采用BCA法測(cè)定提取蛋白濃度。以30μg的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h后在4℃孵育DAB2或actin一抗過夜。過夜后，室溫孵育二抗1 h后，TBST搖洗10 min，3次后，ECL方法進(jìn)行曝光。

1.5 免疫組化（IHC）檢測(cè)DAB2的表達(dá)

取新鮮組織，乙醇梯度脫水之后進(jìn)行石蠟包埋。常規(guī)切片（5μm）、脫蠟、水化后，放入數(shù)控?zé)峥乖迯?fù)儀進(jìn)行抗原修復(fù)。采用過氧化氫阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶之后，4℃孵育DAB2或actin一抗過夜后，TBST洗滌后室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗0.5 h，采用DAB方法進(jìn)行顯色，蘇木素染核。最后，進(jìn)行梯度脫水和二甲苯透明后，采用中性樹脂進(jìn)行封片觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

該次研究采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-aPCR和Western blotting檢測(cè)DAB2在肝癌中表達(dá)水平

收集肝癌患者的組織樣本，提取RNA后采用RTαPCR檢測(cè)患者癌和癌旁組織中DAB2的mRNA表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，DAB2在肝癌癌旁組織中的表達(dá)水平顯著高于癌組織(1.92±0.85)vs（1.27±0.81）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.330，P<0.001)，見圖1。同時(shí)檢測(cè)DAB2的蛋白表達(dá)水平后也發(fā)現(xiàn)，DAB2在肝癌癌旁組織中的表達(dá)水平顯著高于癌組織，見圖2A。進(jìn)一步的定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAB2在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（0.31±0.15)vs(0.79±0.20),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.530，P<0.001)，見圖2B。以上結(jié)果提示，DAB2在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。

圖2 肝癌和癌旁組織中DAB2的蛋白表達(dá)水平Figure 2 DAB2 protein expression levels in liver cancer and adjacent tissues

2.2 IHC檢測(cè)DAB2在肝癌組織中的表達(dá)

為了進(jìn)一步確認(rèn)DAB2在肝癌組織中的表達(dá)情況，該研究還采用IHC方法對(duì)組織中DAB2的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，DAB2在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，見圖3，提示DAB2在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。

圖3 IHC檢測(cè)DAB2在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)Figure 3 IHC detection of DAB2 expression in liver cancer and adjacent tissues

2.3 DAB2表達(dá)與肝癌臨床表征關(guān)系

由上文的研究可發(fā)現(xiàn)，DAB2在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。因此，該研究根據(jù)肝癌組織中DAB2表達(dá)是否低于癌旁組織，將納入的51例肝癌患者分為DAB2的高表達(dá)組（n=15）和DAB2的低表達(dá)組（n=36），然后分析比較DAB2表達(dá)與肝癌患者臨床表征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者的性別、年齡（55.13±16.64）歲vs（55.50±11.00）歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.094，P=0.926)、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是腫瘤組織中低表達(dá)患者的腫瘤分期和血管侵襲發(fā)生率顯著高于高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），而高分化程度及未發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移則顯著低于高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 DAB2表達(dá)與肝癌患者臨床表征關(guān)系[n(%)]Table 1 The relationship between DAB2 expression and clinical manifestations of liver cancer patients[n(%)]

3 討論

HCC是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除和肝移植目前是HCC根治性的治療手段。但由于HCC發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，多數(shù)的患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展到HCC的中后期，仍存在部分患者無法進(jìn)行根治性手術(shù)的治療[5]。因此，深入研究HCC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的、有效的HCC的控制手段對(duì)于提高HCC患者的診療效果尤為重要。近年來，有大量的研究報(bào)道HCC的發(fā)病機(jī)制，但是HCC的發(fā)病機(jī)理仍未完全闡述清楚。

DAB2是人5號(hào)染色體編碼的長度約為3.6 kb的mRNA。DAB2蛋白主要通過3個(gè)功能區(qū)域進(jìn)行分子活動(dòng)的調(diào)控：N段的磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)或磷酸作用區(qū)和C-端的脯氨酸區(qū)域[6]。其中N段的磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)域和磷酸作用區(qū)域是轉(zhuǎn)錄因子受體TGF-β信號(hào)通路所必需，因此研究DAB2在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制對(duì)于有效控制TGF-β信號(hào)通路異常的癌癥的發(fā)展過程具有重要意義。早期研究表明，DAB2蛋白表達(dá)水平在95%的非小細(xì)胞肺癌組織中顯著降低；相較于癌旁組織，DAB2 mRNA在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)下降達(dá)到60%左右[7]。與健康組織相比，DAB2在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)也顯著降低，沉默DAB2的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。前列腺癌組織中DAB2的表達(dá)也顯著低于癌旁組織，下降約80%左右，miRNA-93能夠通過靶向下調(diào)DAB2促進(jìn)前列腺癌發(fā)展過程[9]。該研究中采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)肝癌及癌旁組織樣本發(fā)現(xiàn)，DAB2 mRNA表達(dá)水平在肝癌組織中的表達(dá)水平相較于癌旁組織下降60%左右，western blot檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)DAB2在肝癌組織中表達(dá)均顯著低于癌旁組織，以上研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。有學(xué)者應(yīng)用免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DAB2在乳腺癌組織中異常低表達(dá)，其中76%(58/76)乳腺癌樣本中基本檢測(cè)不到DAB2的表達(dá)，DAB2表達(dá)缺失能夠顯著削弱其對(duì)TGF-β的抑制作用而促進(jìn)Treg細(xì)胞的發(fā)展[10]。Yuan C等人[11]的研究也發(fā)現(xiàn)miR-106b能夠通過靶向TGF-β信號(hào)通路中DAB2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移。該研究中同樣采用免疫組化手段對(duì)HCC癌組織和癌旁組織中的DAB2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DAB2在癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織。以上的研究表明，DAB2可能通過TGF-β信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的抑癌作用。

近年來的臨床研究顯示，DAB2與多種腫瘤患者臨床病理特征密切相關(guān)。Wang等人[12]在食管癌的研究中發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的DAB2能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展、腫瘤的復(fù)發(fā)，導(dǎo)致不良預(yù)后。非小細(xì)胞肺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)的DAB2與非小細(xì)胞肺癌早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥性及不良預(yù)后呈顯著正相關(guān)關(guān)系[13-14]。結(jié)合患者的臨床信息，該研究對(duì)DAB2表達(dá)與患者的臨床病理特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)DAB2與患者的腫瘤分期、血管侵襲及分化程度有顯著關(guān)系，與前人研究結(jié)論一致。近期Sun等人[15]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-106在肝癌組織中顯著高表達(dá)，其能夠通過靶向下調(diào)DAB2表達(dá)促進(jìn)肝癌下部的增殖和轉(zhuǎn)移。以上的研究結(jié)果提示，DAB2能夠通過抑制肝癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，但是具體的調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步的挖掘。

綜上所述，DAB2的表達(dá)在HCC中顯著下調(diào)，且與患者的腫瘤分期、血管侵襲和分化程度密切相關(guān)，提示DAB2在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，深入研究DAB2在HCC的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于提高HCC的診療效果具有重要意義。