楊德泉，佘永紅

湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000

紅黑二丸，又名紅白二丸、巖丸子、鴛鴦七、山海棠，是一味土家族常用藥材，土家語(yǔ)稱捏龍免姐［1］。土家醫(yī)藥理論認(rèn)為，紅黑二丸性微冷，味酸、辣。具有趕火止瀉，活血療傷，止血等功效。土家醫(yī)臨床用于熱瀉癥、心口痛、跌打傷痛、血熱出血、痢疾、淋濁、白濁、毒蛇咬傷等病癥［2,3］。紅黑二丸中含有β-谷甾醇、豆甾醇、表兒茶酸、表兒茶醛、表兒茶素、兒茶素等成分［4-6］。紅黑二丸雖常用于土家族醫(yī)臨床，但尚無(wú)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為控制紅黑二丸藥材質(zhì)量，筆者通過(guò)民間用藥調(diào)查，參考有關(guān)文獻(xiàn)［7-10］，對(duì)其性狀、顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別研究，建立了以β-谷甾醇為成分指標(biāo)的TLC鑒別方法及HPLC含量測(cè)定方法，為建立紅黑二丸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀［包括VWD檢測(cè)器，Rev.B.03（16）化學(xué)色譜工作站］；AUW 220D電子天平；RMZ126RT型石蠟切片機(jī)［型號(hào)：RM2126RT，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司］；OLYMPUS BX61電動(dòng)顯微鏡；超聲波清洗器（型號(hào)：KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司）；SONY數(shù)碼單反相機(jī)（型號(hào)：DSLR-A450，索尼公司）。

1.2 試藥

β-谷甾醇（批號(hào)110851-201608，供含量測(cè)定用，含量以97.0%計(jì)）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板購(gòu)于德國(guó)化工技術(shù)（上海）有限公司和青島海洋化工廠分廠。乙腈、異丙醇為色譜純，水為純凈水，其余均為分析純。紅黑二丸藥材經(jīng)楊德泉主任藥師鑒定為中華秋海棠Begonia grandisDry.subsp.Sinensis（A.DC.）Irmsch.。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀鑒別

塊莖呈扁圓球形或不規(guī)則塊狀，直徑0.7～3.0 cm。表面棕紅色至黑褐色，有不規(guī)則的皺紋。上端凹凸窩狀，偶有葉柄殘留須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，不易折斷，斷面類白色或淡紅棕色，粉性，散在微小的亮星。氣微、味微苦。見(jiàn)圖1。

2.2 顯微鑒別

2.2.1 根莖橫切片木栓細(xì)胞4～6列，切向延長(zhǎng)、表面觀長(zhǎng)方形或多角形。木栓細(xì)胞外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)表皮細(xì)胞，表皮細(xì)胞外側(cè)附有角質(zhì)層，表皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)常有受到擠壓的薄壁細(xì)胞。木栓層內(nèi)為薄壁細(xì)胞區(qū)，其內(nèi)散生維管束，維管束中導(dǎo)管束明顯，可見(jiàn)形成層和韌皮部，但形成層大多不明顯。皮層、中柱和髓部無(wú)明顯分界。薄壁細(xì)胞中含淀粉粒，有的含有簇晶或集合成簇狀的細(xì)小針晶群。顯微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

2.2.2 粉末特征粉末淺黃棕色。淀粉粒眾多，單粒，圓形、橢圓形，層紋明顯，臍點(diǎn)點(diǎn)狀，直徑15～30 nm。草酸鈣針晶細(xì)小而多，呈簇狀存在，簇狀團(tuán)塊直徑20～30 nm，可見(jiàn)簇晶。導(dǎo)管為環(huán)螺紋，直徑25～35 nm。木栓化細(xì)胞多角形，壁略平直。殘存的表皮細(xì)胞上偶見(jiàn)單細(xì)胞腺毛，內(nèi)含紅棕色分泌物，直徑15～25 nm。顯微特征見(jiàn)圖3。

2.3 薄層色譜鑒別

取紅黑二丸粉未（過(guò)4號(hào)篩）0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得供試品溶液；另稱取β-谷甾醇10 mg置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖4 。

2.4 HPLC含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件色譜柱：Agilent 5 TC C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-異丙醇（70∶30）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取β-谷甾醇20.40 mg,置20 mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，作為β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，濃度為0.989 mg/mL。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液3 mL置于50 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，制成每1 mL含59.34 μg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加乙醇25 mL，超聲處理40 min，放冷，過(guò)濾，濾液揮干，加乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。同步稱取樣品粉末，測(cè)定水分，按干燥品計(jì)算含量。

2.4.4 陰性樣品溶液的制備取乙醇25 mL，置50 mL錐形瓶中，同供試品溶液制備方法操作，即得。

2.4.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按“2.4.1”色譜條件測(cè)定，樣品中β-谷甾醇與其他組分的色譜峰分離度大于1.5，與對(duì)照品對(duì)應(yīng)的色譜峰的理論板數(shù)不低于16 000。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上檢出色譜峰。對(duì)照品、樣品及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖5。

2.4.6 線性關(guān)系考察精密吸取β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，混勻，得197.8 μg/mL的溶液，再分別精密吸取0.5、1、2、3、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，配制成9.89、19.78、39.56、59.34、98.9、197.8 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。

分別精密吸取上述系列對(duì)照品溶液20 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，得β-谷甾醇的回歸方程：Y=335.73X+3.401 5，r=0.999 9。結(jié)果表明：β-谷甾醇進(jìn)樣量在0.197 8～3.956 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.7 精密度實(shí)驗(yàn)取同一濃度對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，β-谷甾醇峰面積的RSD為0.65%。

2.4.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取采于吉首市寨陽(yáng)村樣品6份，分別按樣品測(cè)定法測(cè)定。測(cè)定含量分別為0.271 1、0.268 2、0.275 2、0.266 9、0.266 0、0.267 8 mg/g，平均含量為0.269 2 mg/g，RSD為1.2%。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，于0、1、4、6、12 h，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.10 加樣回收率試驗(yàn)取采于吉首市寨陽(yáng)村的樣品（含量為0.269 2 mg/g）6份，置50 mL錐形瓶中,分別吸取濃度為0.059 34 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.1 mL，按供試品溶液的方法制備。照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，平均回收率為97.3%，RSD為2.9%。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 樣品含量測(cè)定

精密稱取不同批次的紅黑二丸藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.5 g，按“2.4.3”項(xiàng)下下方法制備供試品溶液，并按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出β-谷甾醇的含量，11批樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 紅黑二丸中β-谷甾醇含量

3 討論

民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究建立，是合理、安全、有效應(yīng)用民族藥的保證，對(duì)民族藥走向現(xiàn)代化有極其重要的意義。本文通過(guò)對(duì)紅黑二丸藥材的性狀、顯微、薄層色譜、含量測(cè)定的研究，為建立紅黑二丸藥材標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。β-谷甾醇具有保護(hù)胃黏膜［11］、促凝血、活血化瘀、抗炎鎮(zhèn)痛、止瀉等［12］藥理活性，與土家醫(yī)臨床應(yīng)用紅黑二丸治療熱瀉癥、心口痛、跌打傷痛、血熱出血、痢疾等病癥相符合。選擇β-谷甾醇作為紅黑二丸藥材標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分，使該藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式和標(biāo)準(zhǔn)關(guān)聯(lián)，為民族藥臨床應(yīng)用提供了科學(xué)理論支撐。