張卉 王姝 李雪娜 李亞明

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學科，沈陽 110001

肺癌是世界范圍內(nèi)致死率較高的惡性腫瘤之一，近年來肺癌在我國的發(fā)病率和病死率均高居首位，其主要原因在于肺癌的高侵襲轉移能力和高復發(fā)率[1]。非小細胞肺癌是肺癌中發(fā)病率最高的類型，手術治療和放化療是最常用和最基本的治療手段，但預后依然較差，5 年生存率不足17%[2]。因此，研究肺癌的代謝及轉移機制在一定程度上能提高肺癌的診療效果，進而降低肺癌的病死率。

在RNA 中，大部分為非編碼RNA，其中長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）長度一般超過200 bp，且缺乏明顯的開放閱讀框，因此其不編碼蛋白質(zhì)，但是廣泛參與人體生理、病理活動，包括參與或介導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[3-3]。早期研究結果發(fā)現(xiàn)，lncRNA 尿路上皮癌胚抗原（urothelial carcinoma associated，UCA）1 在多種腫瘤細胞中表達上調(diào)，降低UCA1 的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖、轉移等生物學行為，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的葡萄糖代謝[4]，因此UCA1 可作為腫瘤早期診斷、預后監(jiān)測的新型生物標志物[5-6]。

本研究首先通過檢測lncRNA UCA1 在肺腺癌A549 細胞中的表達，然后體外實驗進一步驗證lncRNA UCA1 在肺腺癌中的作用，旨在進一步揭示肺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，并為lncRNA UCA1 作為肺癌新的早期診斷指標及治療靶點提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

肺腺癌A549 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院，人正常支氣管上皮細胞HBE 購自中國科學院細胞庫，胎牛血清購自美國CLACK 公司，DMEM/F12 細胞培養(yǎng)基、青-鏈霉素雙抗和胰蛋白酶均購自美國Hyclone 公司，Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000 和Trizol 試劑均購自美國Invitrogen 公司，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（RR820A）、PrimeScriptTMRT reagent 試 劑 盒（RR047A）購自日本Takara 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠快速制備試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，抗體均購自美國ABcam 公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司。18F-FDG由本科室的美國GE 公司的MINItrace 加速器合成，放射化學純度＞95%。Image Lab 圖像分析系統(tǒng)為美國伯樂公司生產(chǎn)，γ 計數(shù)器（GC-1500）為安徽中科中佳科學儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

人正常支氣管上皮細胞HBE 培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中，肺腺癌A549 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中，均置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（內(nèi)含5%CO2）；然后加1 mL 胰蛋白酶消化收集細胞，再用1 mL 無雙抗的完全培養(yǎng)基中和，重懸為細胞懸液，按1×105個數(shù)量接種于六孔板中，待細胞密度約為70%時，進行轉染。將小干擾RNA（small interfering，siRNA）轉染細胞分為NC 組（陰性對照組，轉染siRNA-UCA1 序列）和siRNA-UCA1 組（轉染siRNA-UCA1 敲降序列），以上序列由上海吉凱公司設計合成。轉染24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用Trizol 試劑裂解細胞，用于檢測干擾效率。

1.3 UCA1 的干擾效率驗證與糖代謝的相關指標檢測

提取人正常支氣管上皮細胞HBE 和肺腺癌A549 細胞的RNA，進行反轉錄反應（去除基因組DNA 和反轉錄反應）和實時熒光定量（quantitative real-time，qRT）PCR 反應，后者包括預變性95℃30 s，反應40 個循環(huán)，溶解95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 5 s、4℃降溫30 s 等步驟。并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，通過2-△△CT法計算以上2 種細胞的UCA1 相對表達量，檢測肺腺癌A549細胞的糖代謝相關指標：己糖激酶（hexokinase，HK）2、葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter protein，GLUT）1 和丙酮酸激酶（pyruvate kinase isozymes M，PKM）2 的表達量，以β-actin 為內(nèi)參。引物序列如下：

GAPDH 引物序列：

正向5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′

反向5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′

β-actin 引物序列：

正向5′-GCAGAAGGAGATCACTGCCCT-3′

反向5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′

UCA1 引物序列：

正向5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′

反向5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′

GLUT1 引物序列：

正向5′-ATACTCATGACCATCGCGCTAG-3′

反向5′-AAAGAAGGCCACAAAGCCAAAG-3′

HK2 引物序列：

正向5′-GGCAATGAAACCAAAGCCAGGAG-3′

反向5′-GGAAGGAGGAGCCAGAAGCAACC-3′

PKM2 引物序列：

正向5′-GGGTTCGGAGGTTTGATG-3′

反向5′-ACGGCGGTGGCTTCTGT-3′

1.4 Transwell 實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲及遷移

肺腺癌A549 細胞轉染48 h 后，先用胰蛋白酶消化，再用無血清培養(yǎng)基稀釋，以2×105個的數(shù)量加入上室中。在下室加入600 μL 含20%血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，將上室放入后繼續(xù)培養(yǎng)。8 h后取出上室，用4%的多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，用PBS 進行清洗后，擦去上室內(nèi)殘留細胞，晾干拍照。實驗至少重復3 次。

細胞轉染48 h 后進行劃痕實驗，用10 μL 加樣器的槍頭垂直于六孔板劃一道豎線，PBS 清洗1 次后進行拍照，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后再進行拍照，盡量選擇同一視野。使用Image J 軟件（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）測各個時間點細胞未覆蓋的面積。

劃痕愈合率（%）=1-（各時間點劃痕面積/開始的劃痕面積×100%）

1.5 Western blot 檢測糖代謝相關蛋白

肺腺癌A549 細胞轉染48 h 后，用PBS 清洗再加入裂解液，冰上裂解30 min，4℃離心（17 000×g）25 min 后取上清，進行蛋白濃度測定，電泳儀設置電壓為80 V 跑電泳，至分離膠和濃縮膠交界處時將電壓更改為120 V，至樣品跑出即可停止電泳。5%脫脂奶封閉2 h，一抗為HK2（1∶1000）、GLUT1（1∶2000）、PKM2（1∶1000），以β-actin（1∶10000）為內(nèi)參，4℃ 過夜后，第2 天用TBST（Tris buffered Tween）緩沖液清洗3 次，每次15 min。山羊抗兔二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次后進行化學發(fā)光法檢測和曝光拍照，結果用image-Lab 圖像分析系統(tǒng)測定各條帶的灰度值，計算HK2、GLUT1 和PKM2 的相對表達量，實驗重復3 次。

1.6 18F-FDG 攝取實驗

六孔板內(nèi)未轉染的肺腺癌A549 細胞每孔加入37 000 Bq 的18F-FDG，37℃分別孵育5、15、30、60、90、120 min，計算不同時間點18F-FDG 的攝取率，選取攝取率最高的時間點進行后續(xù)實驗。肺腺癌A549 細胞在六孔板內(nèi)轉染48 h 后，每孔加入0.296 MBq（8 μCi）/mL 的18F-FDG，37℃孵育60 min，吸取上清液后用1 mL 的PBS 清洗3 次。用胰蛋白酶消化細胞，收集后用1 mL 的PBS 再清洗3 次，均加入試管中，最后用γ 計數(shù)器測量每個試管內(nèi)的放射性計數(shù)，計算細胞對18F-FDG 的攝取率：18F-FDG 攝取率=細胞內(nèi)放射性計數(shù)/（細胞內(nèi)放射性計數(shù)+上清液放射性計數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析

以上所有實驗均重復3 次以確保結果的可靠性。采用SPSS20.0 軟件和GraphPad Prism7.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，方差齊的2組數(shù)據(jù)的比較采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UCA1 在A549 細胞中的表達

用qRT-PCR 檢測人正常支氣管上皮細胞HBE和肺腺癌A549 細胞中UCA1 的表達時發(fā)現(xiàn)，UCA1 在A549 細胞中的表達顯著升高，是在HBE中表達量的4.26 倍，且差異有統(tǒng)計學意義（t=16.26，P＜0.001）。

2.2 siRNA-UCA1 對GLUT1、 HK2 和PKM2 的影響

qRT-PCR 結果顯示，UCA1 的siRNA 轉染能夠抑制肺腺癌A549 細胞GLUT1、HK2 和PKM2基因的表達（圖1）。進一步的Western blot 結果表明，與NC 組相比，siRNA-UCA1 組的GLUT1、HK2和PKM2 蛋白的表達水平均明顯下降，且差異均有統(tǒng)計學意義（圖2）。

2.3 LncRNA UCA1 對肺腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell 侵襲實驗結果顯示，siRNA-UCA1組和NC 組細胞穿過數(shù)量分別為（12.0000±0.5774）、（127.7000±5.9250）個（圖3），說明下調(diào)UCA1 時，肺腺癌細胞的侵襲能力與對照組相比顯著降低（t=19.43，P＜0.001）。

劃痕實驗結果顯示，經(jīng)過24 h 的爬行，與NC 組相比，siRNA-UCA1 組細胞的遷移運動能力明顯降低（圖4）。

2.4 siRNA-UCA1 對肺腺癌細胞18F-FDG 攝取率的影響

未轉染的肺腺癌A549 細胞在5、15、30、60、90、120 min 時對18F-FDG 的攝取率分別為1.95%、2.28%、2.55%、2.86%、2.40%、2.34%，60 min 時的攝取率達到峰值，因此選擇60 min 作為測定的時間點。轉染后的肺腺癌A549 細胞測定結果如圖5 顯示，siRNA-UCA1 組對18F-FDG 的攝取率較NC 組明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 qRT-PCR 檢測3 種基因的表達情況 圖中，a：與NC 組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（t=19.66、5.81、11.98，均P<0.001）。qRT-PCR：實時熒光定量聚合酶鏈式反應；siRNA-UCA1：小干擾RNA 下調(diào)尿路上皮癌胚抗原1；GLUT：葡萄糖轉運蛋白；HK：己糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；NC：陰性對照Fig. 1 qRT-PCR was used to detect the expression of three genes

圖2 Western blot 檢測3 種蛋白的表達情況 圖中，a：與NC 組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（t=61.35、145.90、88.19，均P<0.001）。siRNA-UCA1：小干擾RNA 下調(diào)尿路上皮癌胚抗原1；GLUT：葡萄糖轉運蛋白；HK：己糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；NC：陰性對照Fig. 2 Western blot was used to detect the expression of three proteins

圖3 siRNA-UCA1 對肺腺癌A549 細胞侵襲能力的影響（結晶紫染色，×400） 圖中，a：與NC 組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.43，P<0.001）。siRNA-UCA1：小干擾RNA 下調(diào)尿路上皮癌胚抗原1；NC：陰性對照Fig. 3 Effect of siRNA-urothelial carcinoma associated 1 on the invasive ability of lung adenocarcinoma A549 cells（ crystal violet staining, ×400）

圖4 siRNA-UCA1 對肺腺癌A549 細胞遷移能力的影響（×100） 圖中，a：與NC 組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.71，P=0.002）。siRNA-UCA1：小干擾RNA 下調(diào)尿路上皮癌胚抗原1；NC：陰性對照Fig. 4 Effect of siRNA-urothelial carcinoma associated 1 on the migration ability of lung adenocarcinoma A549 cells（×100）

圖5 siRNA-UCA1 對肺腺癌A549 細胞18F-FDG 攝取率的影響 圖中，a：與NC 組相比，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.79，P=0.004)。siRNA-UCA1：小干擾RNA 下調(diào)尿路上皮癌胚抗原1；FDG：氟脫氧葡萄糖；NC：陰性對照Fig. 5 Effect of siRNA-urothelial carcinoma associated 1 on the 18F-FDG uptake rate of lung adenocarcinoma A549 cells

3 討論

目前針對惡性腫瘤的治療手段包括手術切除并行同步放化療，但整體預后仍不理想[7]。因此，研究肺癌病變的確切機制和發(fā)現(xiàn)新的關鍵靶點至關重要，對開展肺腺癌患者的個體化治療和改善預后具有重要意義。

代謝重編程是腫瘤細胞的標志之一，并且與細胞生長調(diào)節(jié)的過程密切相關[8]。FDG 是一類葡萄糖類似物，可以反映葡萄糖的代謝情況。近年來隨著PET 類的醫(yī)學成像設備被臨床廣泛應用，F(xiàn)DG可以用于腫瘤的診斷、分期和治療監(jiān)測。由于細胞在快速增殖侵襲過程中所需的能量會急劇增加，可加快腫瘤發(fā)生發(fā)展的進程[9-10]，因此研究腫瘤的代謝調(diào)節(jié)過程有利于尋找更好的治療靶點。而lncRNA最開始被認為是基因轉錄的副產(chǎn)物，不存在生物學功能[11]。但近年來的研究結果表明，lncRNA 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，已成為基因組學新的研究熱點[12-13]。

目前，有研究結果表明UCA1 在肺癌細胞中呈高表達狀態(tài)，并且可以促進小細胞肺癌的生長、侵襲和遷移[14-15]，與本研究的結果一致。除此之外，本研究還通過qRT-PCR 及Western blot 實驗檢測UCA1 在A549 細胞糖代謝中的關鍵酶，發(fā)現(xiàn)下調(diào)UCA1 后，GLUT1、HK2 和PKM2 表達均顯著降低，抑制細胞糖代謝的過程，這在國內(nèi)外尚無報道。我們用Transwell 侵襲實驗和劃痕實驗進行生物學行為的檢測，結果表明，下調(diào)UCA1 后會使A549 細胞的侵襲和遷移能力顯著下降，但具體機制仍需要進一步探索。有研究者發(fā)現(xiàn)，UCA1 在胰腺癌中可以通過Hippo 通路促進胰腺癌細胞侵襲和轉移[16]；對肝細胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，UCA1 可以通過與miR-203 結合，激活轉錄因子Snail 2，促進肝癌細胞的增殖和侵襲[17]。因此，UCA1 沉默后，相應糖代謝指標表達降低，抑制腫瘤的能量代謝，使腫瘤侵襲轉移能力下降。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UCA1 可以影響糖代謝的關鍵酶，并且促進肺腺癌A549 細胞的遷移和侵襲，這提示其可能在肺癌發(fā)生過程中起到癌基因的作用，有望成為肺癌治療的潛在新靶點。本研究結果為進一步深入探討UCA1 對促進肺癌細胞惡性生物學特征的分子機制奠定了基礎。由于我們只進行了體外實驗，尚存在不足之處，比如UCA1與臨床病理因素及預后的關系等都值得進一步研究。接下來將進行機制研究，深入探討UCA1 通過哪種信號通路對糖代謝指標進行調(diào)節(jié)，同時加上體外動物實驗進行驗證，以得到更明確的治療效果。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明張卉負責試驗的設計與實施、論文的撰寫；王姝負責數(shù)據(jù)的分析；李雪娜、李亞明負責論文的審閱與修訂。