王 瀚，卓平清，王讓軍，王明霞

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院/隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅隴南 742500；2.成縣核桃科技服務(wù)中心， 甘肅隴南 742500)

0 引言

甘肅隴南成縣氣候溫潤，林果獨特，是甘肅省乃至我國西部重要的核桃產(chǎn)區(qū)之一，被命名為“中國核桃之鄉(xiāng)”.核桃已成為當?shù)氐闹匾?jīng)濟林果產(chǎn)業(yè).截止2016年，該縣栽培面積達34.0×103hm2、1 120萬株，堅果產(chǎn)量達21.44×103t[1].核桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展離不開核桃品種的推廣和繁育，但隨著不同地區(qū)間不同品種核桃接穗的廣泛交流，病害的傳播速度也隨之加快，病害發(fā)生率逐年提升.核桃腐爛病是一種嚴重的危害核桃樹勢的真菌病害，研究表明，該病是一種由殼蕉孢屬(Cytospora)真菌引起的病害，主要靠分生孢子的快速擴散感染樹體，發(fā)病范圍較廣，危害極其嚴重[2-3].

諸多研究發(fā)現(xiàn)，核桃病害是一類復(fù)合型病害.其病原菌除了主要的致病菌之外，尚存在大量其他種類伴生病原菌，它們與主要病原菌一起共同侵染寄主植物.為準確認識并分析核桃腐爛病的傳播途徑及復(fù)合侵染模式，控制其蔓延態(tài)勢，本研究對其伴生病原菌進行了分離鑒定，以期為核桃腐爛病的綜合防治提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 甘肅成縣索池大草灣村(海拔1 433 m，地理坐標33°29’45”N，105°57’30”E)核桃基地核桃腐爛病病斑部位分離得到.

1.1.2 供試培養(yǎng)基及試劑 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，NaCl10.0 g，酵母提取物5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH為7.0～7.5[4].革蘭氏染色試劑盒購自碧云天試劑公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8255/8256)，所需其他分子生物學(xué)試劑均購自上海生工有限公司.

1.2方法

1.2.1 病原菌的分離和培養(yǎng) 野外考察期間，挖開核桃腐爛病表層，以無菌手術(shù)刀挖取核心部位，樣本采回后取核心區(qū)部分黑色組織，置于無菌水中浸泡10 min后，以接種環(huán)蘸取無菌水液后以常規(guī)劃線法在LB平板上劃線，劃線后平板倒置培養(yǎng)24 h后，再挑取單菌落分別以劃線法繼續(xù)純化，培養(yǎng)后得一白色菌落，具木腐味，命名為HBG.將其涂布于試管斜面上放37 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 病原菌的形態(tài)特征研究 取保存好的病原菌后，于30 ℃條件下活化24 h后觀察菌落形態(tài)，后以接種環(huán)刮取少量菌膜，按常規(guī)方法涂片、干燥和固定.先滴加草酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色1～2 min后傾去染液，水洗至流水無色，之后以盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1 min，傾去碘液，水洗至流出水無色，最后以95%酒精脫色，之后復(fù)染，鏡檢觀察[5].

1.2.3 病原菌生理生化特征測定 不同的細菌具有不同的酶系和不同的生理特性，這些特性可以作為細菌鑒定和分類的重要方法.為準確、快速及微量化鑒定該菌株.菌株HGB的生理生化性質(zhì)的測定參照文獻[5]的方法進行.

1.2.4 病原菌生長特性測定 不同的環(huán)境因素對微生物的增殖具有一定的影響.為進一步研究該病原菌在不同溫度下的生長特性，取配制好的LB液體培養(yǎng)基，以5 mL離心管分裝，接種活化菌液后按照4、10、15、20、25、30、35、40℃設(shè)置處理溫度，每個溫度設(shè)置3個平行，培養(yǎng)24 h后分別吸取少量菌液測定OD600；為進一步研究pH值對該菌株增殖的影響.取配制好的LB液體培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接種活化菌液后培養(yǎng)24 h測定菌液的OD600；為進一步研究該病原菌的增殖規(guī)律，將活化菌液分別接種于LB液體培養(yǎng)基中于25℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h，其中每隔2 h測定OD600，并以此值繪制生長曲線.

1.2.5 病原菌16S rDNA基因序列分析 分離到的菌株經(jīng)純培養(yǎng)后，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8255/8256)提取細菌基因組DNA，采用細菌16S rDNA通用引物27F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG和1492R：TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T擴增細菌的16S rDNA，將PCR擴增產(chǎn)物回收后送上海生工有限公司測序.測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌HBG菌落形態(tài)

該細菌為短桿狀，菌落較小，白色，邊緣整齊，菌落周圍分泌出粘性物質(zhì)(見圖1).經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陰性菌(G-).隨著培養(yǎng)時間的延長，可聞見木腐味.

2.2 病原菌HBG的生長特性

溫度是生命體存活的最基本環(huán)境因素之一.對于細菌而言，其生長溫度范圍有些較寬、有些較窄.但是對于植物病原菌而言，其增殖的溫度范圍一般與其宿主正常生長的溫度范圍保持一致.通過測定溫度對該菌株HBG的影響，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為25～30 ℃(圖2).pH值決定生物大分子表面的電荷變化，進而影響其活性的變化.對該病原菌而言，其最佳pH值范圍為6.0～8.0，最適值pH值為7.0左右(圖3).生長曲線表明，該病原菌培養(yǎng)12 h后，細菌開始從對數(shù)生長期緩慢增至平臺期，36 h后逐漸進入衰退期(圖4).

2.3 病原菌HBG生理生化特征

病原菌Pantoeasp. HBG生理生化結(jié)果見表1.該菌株具有運動性、菌株成團、其接觸酶、甲基紅、V-P試驗及吲哚實驗均為陽性.其淀粉及精氨酸分解能力為陰性.經(jīng)葡萄糖、乳糖、麥芽糖及蔗糖發(fā)酵試驗，均呈陽性.這些特征均與Pantoeasp.非常相似[6].

2.4 病原菌HBG的16S rDNA序列分析

以該菌株DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度為1 375 bp的擴增產(chǎn)物(圖5)，將測序結(jié)果通過 BLAST (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/) 進行分析，挑取BLAST 結(jié)果中相似菌株，用 Mega 7 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建(圖6).發(fā)現(xiàn)該菌株與Pantoeasp. NIIST-167(FJ445)聚為一枝，結(jié)合形態(tài)特征及生理生化特征，確定該菌株屬于Pantoea，命名為Pantoeasp. HBG.

注:M 為 Marker.圖5 病原菌Pantoea sp. HBG 電泳圖Fig.5 Electrophoresis of Phytopathogenic bBacteria Pantoea sp. HBG圖6 病原菌Pantoea sp. HBG的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic Tree of Phytopathogenic Bacteria Pantoea sp. HBG

3 討論

核桃腐爛病是影響核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種重要的真菌病害，目前認為其發(fā)病的主要機理在于影響核桃樹皮層下韌皮部，進而影響到植物根對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收.另外由于腐爛病的發(fā)生影響到了核桃樹體對于礦質(zhì)元素的吸收.研究表明，氣溫及其他病害發(fā)生也常常造成核桃腐爛病的發(fā)生[7].

對植物病害研究而言，病原的分離及鑒定是至關(guān)重要的.但是，由于植物受病害影響的程度不同、病原物分離方法的差異及其鑒定方法的不同，最終導(dǎo)致該病的病原菌的種類存在差異.目前諸多研究表明其病原菌為殼蕉孢屬(Cytospora)，但種類不盡一致.如國內(nèi)最早的文獻報道病原為CytcosporajuglandicolaEll et Barth，屬于半知菌亞門[8]；黃治民等研究報道為Cytosporajuglandis(DC.) Sacc.[9-10]；馬榮等報道為Cytosporachrysosperma[11]；岳朝陽等人報道為Cytosporasp[2,12-16]，均屬于殼蕉孢屬(Cytospora).張海軍等[17]分離出的菌株鑒定為Phomasp.為莖點霉屬；郭開發(fā)等[18]分離鑒定出新疆核桃腐爛病病原為Chrysosperma.

病原微生物侵染植物體通常是復(fù)合侵染，其病原存在多樣性.不同的病原菌在侵染過程中扮演的角色是不同的，它們之間存在拮抗作用或協(xié)同作用.對于真菌引發(fā)的病害，其病原同樣存在多樣性，通常是真菌、細菌甚至植物病毒侵染植物體.這在經(jīng)濟作物病害研究方面已有相關(guān)報道.如張智慧等[19]報道，三七根腐病病原菌除了腐皮鐮孢菌Fusariumsolani、細鏈格孢菌Alternariatenuis、壞損柱孢菌Cylindrocarpondestructans和黃腐病菌Cylindrocarpondidynum等真菌外，也存在一些其他伴生細菌，共同引發(fā)三七的根腐病.泛菌屬細菌是一類重要的土壤腐生細菌，三七根腐病中泛菌屬的細菌，占39.33%.經(jīng)分離鑒定為成團泛菌Pantoeaagglomerans.對核桃而言，成團泛菌的危害程度更甚于黑斑病的病原菌[20].

在本研究中，在核桃腐爛病的病斑部位分離到泛菌屬的細菌(Pantoeasp.).經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，該菌菌落為白色，呈粘稠狀，具木腐味.該菌在和其他真菌病原侵染核桃莖干時形成粘稠狀、濕潤的液體環(huán)境，一方面保證了這種腐生型細菌的快速增殖，另一方面這種腐生環(huán)境也給核桃腐爛病的其他病原菌提供了較好的微環(huán)境，在核桃腐爛病的發(fā)生及蔓延過程中扮演著重要作用.但其具體感染途徑及其扮演的角色尚需進一步研究證實.