王凱 高帥

原發(fā)性肝癌是目前我國第四位的常見惡性腫瘤及第三位的腫瘤致死病因，嚴(yán)重威脅我國人民的生命和健康[1]。在我國，肝癌的高危人群主要包括：感染乙型肝炎病毒和（或）丙型肝炎病毒、長期酗酒、非酒精性脂肪性肝炎、食用被黃曲霉毒素污染食物、各種原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史等的人群，尤其是年齡40歲以上的男性風(fēng)險(xiǎn)更大。外科手術(shù)治療是肝癌的主要治療方式之一。然而，大部分患者確診時(shí)已達(dá)中晚期，能獲得手術(shù)切除機(jī)會(huì)的患者僅有20%～30%[2]。對(duì)肝癌高危人群進(jìn)行篩查，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療小肝癌，是提高肝癌療效的關(guān)鍵。影像學(xué)檢查和血清分子診斷標(biāo)記物是當(dāng)前肝癌早期篩查的主要手段。影像學(xué)檢查主要包括B超、CT和磁共振等，通過直觀的肝臟占位性腫瘤包塊來判斷肝癌[3]。分子診斷標(biāo)記物的檢測在原發(fā)性肝癌的篩查、早期診斷、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)檢測等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。

近年來，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科向癌癥研究領(lǐng)域的延伸，肝癌分子診斷標(biāo)記物的研究取得了巨大的進(jìn)展。本文將對(duì)近年來肝癌分子診斷標(biāo)記物的研究做一綜述，以期對(duì)后期的臨床工作和科學(xué)研究提供指導(dǎo)。

1 肝癌相關(guān)基因

正常細(xì)胞的生長與增殖受兩大類基因調(diào)控。原癌基因提供正向調(diào)控信號(hào)，其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和增殖，并且阻止其發(fā)生終末分化傾向。抑癌基因提供負(fù)向調(diào)控信號(hào)，促使細(xì)胞成熟、終末分化和細(xì)胞凋亡。正常情況下這兩類信號(hào)保持著動(dòng)態(tài)平衡，精準(zhǔn)地調(diào)控細(xì)胞增殖和成熟。一旦這兩類信號(hào)中有一類信號(hào)過強(qiáng)或過弱均會(huì)使細(xì)胞生長失控而導(dǎo)致惡變。研究顯示，多種致癌基因參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展。這些基因改變與腫瘤抑制基因、癌基因、發(fā)育途徑的激活、生長因子及其受體相關(guān)，導(dǎo)致肝癌在細(xì)胞水平上保持異常高的復(fù)制水平，并使細(xì)胞避免凋亡的過程。

其中，具有代表性的基因如PTEN基因、p53基因、IGF-2基因、TGF-α基因、c-myc基因、ras基因等，直接參與介導(dǎo)肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并可作為肝癌早期診斷的特異性分子標(biāo)記物[4]。Chen等人的研究中發(fā)現(xiàn)，大約50.3%的肝癌組織中可檢測到PTEN基因的低表達(dá)，與CD133、Ep CAM和CK19的高表達(dá)呈正相關(guān)。PTEN基因低表達(dá)是肝癌復(fù)發(fā)和總體生存率的獨(dú)立預(yù)測因素[5]。Liao等人通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，P53基因相關(guān)信號(hào)通路是導(dǎo)致乙型肝炎相關(guān)肝癌發(fā)生、發(fā)展的核心通路之一[6]。另一項(xiàng)研究顯示，c-myc可與HBx協(xié)同誘導(dǎo)非經(jīng)典前折疊素RPB 5相互作用因子1（URI1）蛋白的表達(dá)升高，從而促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展[7]。Ha等人的研究中，IGF-2介導(dǎo)的E-cadherin蛋白缺失是導(dǎo)致小鼠肝腫大和肝癌細(xì)胞異常生長的關(guān)鍵因素。HBx誘導(dǎo)的IGF-2是可作為肝癌的潛在生物標(biāo)記物，也是肝癌的治療靶點(diǎn)之一[8]。

2 DNA甲基化標(biāo)記物

表觀遺傳學(xué)是指非遺傳改變（DNA甲基化、組蛋白修飾以及miRNA等非編碼RNA等）對(duì)基因表達(dá)調(diào)控，這種調(diào)節(jié)不依賴基因序列的改變且可遺傳，其中DNA甲基化是最常見的表觀遺傳現(xiàn)象。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控機(jī)制之一，它是以S-腺昔蛋氨酸為甲基供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）介導(dǎo)下，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA某些堿基上的過程。DNA甲基化多發(fā)生在CpG島上，是一種轉(zhuǎn)錄水平的DNA修飾方式，它能調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并且在維持細(xì)胞正常分化、疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用?；騿?dòng)子區(qū)域的DNA甲基化可抑制基因表達(dá)，在惡性疾病的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期復(fù)發(fā)預(yù)測、治療反應(yīng)監(jiān)測及預(yù)后判斷中發(fā)揮重要作用，是目前的熱點(diǎn)研究方向。異常的DNA甲基化位點(diǎn)已經(jīng)成為惡性腫瘤最有前景的分子標(biāo)記物之一[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)，基因組中常見的重復(fù)序列如LINE-1和Alu在肝癌患者中存在明顯的甲基化異常，或可作為肝癌診斷的標(biāo)記物和治療的靶點(diǎn)[10]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌具有特異的基因甲基化特征。在一項(xiàng)研究中，我們分析了178例手術(shù)切除的肝癌組織和20例正常肝組織中TFPI2基因的甲基化狀況。結(jié)果顯示，TFPI2基因在肝癌組織中的甲基化率為44.9%，癌旁組織中的甲基化率為10.7%，正常肝組織中的甲基化率為5.0%。同時(shí)，TFPI2基因甲基化與腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后差明顯相關(guān)[11]。另一項(xiàng)研究中，我們分析了血清游離DNA中IGFBP7基因的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示，肝癌患者血清游離DNA中的IGFBP7基因存在明顯的甲基化，IGFBP7基因甲基化與肝癌患者氧化損傷狀況、術(shù)后總體生存率及早期復(fù)發(fā)率有關(guān)[12]。聯(lián)合應(yīng)用IGFBP7基因甲基化和AFP用于肝癌診斷時(shí)，其診斷效能明顯高于單獨(dú)應(yīng)用AFP[13]。我們進(jìn)一步分析了肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中基因的甲基化狀況，結(jié)果顯示，肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D基因啟動(dòng)子區(qū)域程度明顯高于慢性肝炎患者和正常對(duì)照者，NKG2D基因可作為肝癌診斷的良好生物標(biāo)記物[14]。

3 miRNA

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性短鏈（17-25個(gè)核苷酸）非編碼RNA，其可以與信使RNA（messengerRNA，mRNA）的3’非編碼區(qū)結(jié)合誘導(dǎo)其降解。目前已有約500個(gè)miRNA基因被發(fā)現(xiàn)，其具有廣泛的生物學(xué)功能，可以調(diào)控細(xì)胞重要的生理過程。miRNA既可以作為原癌基因，也可以作為抑癌基因行使功能[15]。在肝癌中，miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化及凋亡、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移、血管新生等腫瘤相關(guān)病理過程。因此，miRNA的水平與肝癌的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，可作為診斷肝癌的候選標(biāo)記物。

已有研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA具有較好的診斷效能。例如，有研究發(fā)現(xiàn)miR-122的水平在肝癌中顯著上調(diào)，在健康人群中應(yīng)用miR-122診斷肝癌的敏感性為90.0%，特異性為94.0%，AUC為0.954，而miR-122鑒別良惡性肝臟腫瘤的敏感性為64%，特異性為62%，AUC為0.667[16]。此外，miR-148a被認(rèn)為是一種肝癌特異性miRNA，與肝硬化患者相比，肝癌患者血漿miR-148a的水平顯著降低，應(yīng)用血漿miR-148水平從肝硬化患者中診斷肝癌的敏感性為89.6%，特異性為89.0%，AUC為0.919，而在AFP水平較低的肝癌患者中，miR-148診斷肝癌的敏感性可達(dá)90.6%，特異性可達(dá)92.6%，AUC為0.949[17]。一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，miR-125b診斷HBV相關(guān)肝癌的敏感性達(dá)95%，特異性達(dá)0.79%，AUC為0.95[18]。對(duì)于此類診斷敏感性較高的miRNA，可用于篩查早期肝癌，特別是在AFP水平較低的患者中更具意義。與單個(gè)miRNA相比，多種miRNA的組合可顯著提高其診斷效能。在一項(xiàng)納入934例受試者的研究中，miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a及miR-801的組合對(duì)于HBV相關(guān)肝癌的診斷具有較高的診斷價(jià)值，其從CHB患者和肝硬化患者中診斷肝癌的AUC分別為0.842和0.884，而對(duì)于早期肝癌（BCLC0期和A期），該組合的診斷AUC達(dá)0.884[19]。

近年來，外泌體miRNA在肝癌中的功能日益受到關(guān)注。一些特定的miRNA可在外泌體中富集，參與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。而外泌體的磷脂膜結(jié)構(gòu)可以使包裹的miRNA在血液中更加穩(wěn)定，具有較高的無創(chuàng)診斷價(jià)值[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，與CHB及肝硬化患者相比，肝癌患者血清外泌體miRNA水平發(fā)生顯著變化，其中，miR-18a、miR-221、miR-222及miR-224水平顯著上調(diào)，而miR-101、miR-106b、miR-122及miR-195水平顯著下調(diào)[20]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與肝硬化相比在肝癌中，血清外泌體miR-122、miR-148a及miR-1246水平顯著上調(diào)，其診斷AUC分別為0.816、0.891、0.785[21]。外泌體miRNA在肝癌早期診斷中的應(yīng)用仍有待于進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

4 LncRNA

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，約占RNA分子的68%[22]。lncRNA可與轉(zhuǎn)錄因子相互作用影響其與靶基因的結(jié)合，也可參與染色質(zhì)重排發(fā)揮增強(qiáng)子作用或作為分子海綿與miRNA或蛋白結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯等多個(gè)水平發(fā)揮其調(diào)控作用[23]。在肝癌中，與miRNA類似，lncRNA也可參與細(xì)胞增殖分化及凋亡、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)腫瘤生物學(xué)過程[24]。

研究表明，多個(gè)lncRNA在肝癌表達(dá)異?；蚬δ苁д{(diào)，如HOTAIR、MALAT-1、HOTTIP、H19、UCA1、HULC、GAS5、MEG3等[25]。其在肝癌中表達(dá)水平的差異為其作為候選診斷標(biāo)記物提供了可能。例如，HEIH作為一種原癌lncRNA，不僅在肝癌肝組織中高表達(dá)，其在HCV相關(guān)肝癌患者血清中表達(dá)也異常升高[26]。Xu等研究了兩種血清外泌體lncRNAENSG00000258332.1和LINC00635用于肝癌診斷的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，與CHB患者及肝硬化患者相比，這兩種血清外泌體lncRNA在肝癌患者血清中均呈高表達(dá)。其中，ENSG00000258332.1從CHB患者中診斷肝癌的敏感性為71.6%，特異性為83.4%，AUC為0.719；而LINC00635用于診斷的敏感性為76.2%，特異性為77.7%，AUC為0.750，均優(yōu)于AFP（敏感性為54.7%，特異性為75.3%，AUC為0.666），而三者聯(lián)合用于診斷AUC可達(dá)0.894（敏感性為83.6%，特異性為87.7%）[27]。這些發(fā)現(xiàn)表明利用lncRNA作為無創(chuàng)診斷標(biāo)記物具有廣闊的應(yīng)用前景。lncRNA應(yīng)用于肝癌早期診斷有待更多大樣本臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

5 蛋白標(biāo)記物

AFP仍然是目前應(yīng)用最廣泛的肝癌診斷標(biāo)記物，以20ng/mL為診斷閾值用于早期肝癌診斷，只有大約1/3患者可以得到診斷。其低敏感性限制了其作為早期肝癌篩查標(biāo)記物的應(yīng)用價(jià)值。而以較低診斷閾值用于早期肝癌診斷，AFP可能獲得更好的敏感性，因此確定AFP的最優(yōu)診斷閾值仍有待于更多研究證據(jù)。為提高AFP的診斷準(zhǔn)確性，AFP可與其他診斷指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用。除AFP以外，其他用于肝癌診斷的蛋白標(biāo)記物也得到了廣泛研究。

AFP具有3種糖化類型，與扁豆凝集素的結(jié)合能力不同，分別為AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。其中，AFP-L3僅來源于腫瘤細(xì)胞，因此被認(rèn)為對(duì)于肝癌具有更好的特異性。AFP-L3的水平與AFP水平高度相關(guān)，但由于其更高的特異性，可用于AFP的替代檢測。在一項(xiàng)縱向研究中，研究者發(fā)現(xiàn)AFP-L3對(duì)于早期肝癌的診斷效能并不優(yōu)于AFP（AUC0.77vs0.73），而AFP和AFP-L3聯(lián)合檢測可獲得更好的診斷效能（AUC0.83），以AFP 5ng/mL及AFP-L34%為診斷截點(diǎn)，二者聯(lián)合檢測的敏感性和特異性可分別達(dá)到79%和97%[28]。

維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)蛋白（protein induced by vitamin K absence orantagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）是因維生素K缺乏誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種異常凝血酶原。在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，維生素K依賴羧化酶系統(tǒng)功能受損，誘導(dǎo)了PIVKA-Ⅱ的產(chǎn)生[29]。在肝癌發(fā)生過程中，其水平顯著升高，因此可作為早期肝癌的篩查標(biāo)記物。在一項(xiàng)來自國內(nèi)的隊(duì)列研究中，Wu等發(fā)現(xiàn)PIVKA-Ⅱ診斷肝癌的效能優(yōu)于AFP（敏感性76.92%vs64.34%，特異性86.26%vs 73.28%），血清PIVKA-Ⅱ的水平與腫瘤大小、分化程度及BCLC分期等均顯著相關(guān)，而對(duì)于早期肝癌的診斷，聯(lián)合PIVKA-Ⅱ（AUC0.812）和AFP（AUC0.797）可得到更高的診斷效能（AUC0.849）[30]。

高爾基蛋白73（Golgi protein-73，GP73）是一種2型高爾基體特異性膜蛋白，廣泛表達(dá)于各種組織上皮細(xì)胞中，而肝細(xì)胞中表達(dá)量較少。然而在肝癌患者中，血清GP73水平顯著升高[31]。Jing等的研究發(fā)現(xiàn)GP73診斷肝癌的敏感性和特異性分別為92.31%和83.87%，陽性預(yù)測值為87.8%，陰性預(yù)測值為89.7%，具有較高的診斷價(jià)值[32]。

鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，廣泛表達(dá)于鱗狀上皮中。其在上皮來源的腫瘤中呈高表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡[33]。由于SCCA的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞去分化的結(jié)果，因此被認(rèn)為是肝癌的潛在標(biāo)記物。Yu等的一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，SCCA診斷肝癌的敏感性為0.61，特異性為0.80，AUC為0.76[34]。此外，在腫瘤發(fā)生的早期，由于SCCA的表達(dá)升高，其可與IgM結(jié)合形成免疫復(fù)合物（SCCA-IgM）。Liu等的一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于肝癌的診斷，SCCA-IgM的準(zhǔn)確性與SCCA相當(dāng)（0.77vs0.80），但其與AFP聯(lián)合應(yīng)用可獲得更高的診斷準(zhǔn)確性（AUC0.90）[35]。

6 小結(jié)與展望

肝癌起病隱匿，大多數(shù)患者在確診時(shí)已錯(cuò)過手術(shù)或治療最佳時(shí)機(jī)[36]。因此，肝癌的篩查和早期診斷對(duì)于治療和預(yù)后具有十分重要的意義。由于肝癌高度的異質(zhì)性，傳統(tǒng)的診斷手段具有一定的局限性。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，我們得以從分子層面窺見肝癌更微觀的生物學(xué)特征。高通量測序、RT-PCR、芯片技術(shù)等分子診斷技術(shù)的發(fā)展使我們能夠檢測遺傳及表觀遺傳學(xué)上DNA、RNA及蛋白水平的改變，并開發(fā)新的無創(chuàng)診斷標(biāo)記物。本文中，我們主要從肝癌相關(guān)基因、DNA甲基化標(biāo)記物、miRNA、lncRNA、以及蛋白標(biāo)記物等方面展現(xiàn)了當(dāng)前肝癌分子診斷標(biāo)記物的研究進(jìn)展。上述研究中我們可以看出，不同類型診斷標(biāo)記物分別具有不同的臨床應(yīng)用特點(diǎn)，可分別用于肝癌的早期診斷、治療方案選擇、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)預(yù)測等方面。同時(shí)，不同類型肝癌診斷標(biāo)記物之間的聯(lián)合應(yīng)用，可增加它們的診斷效能。然而，盡管與傳統(tǒng)診斷標(biāo)記物相比，許多新型分子診斷標(biāo)記物展現(xiàn)出更好的診斷效能，具有較好的轉(zhuǎn)化價(jià)值和應(yīng)用前景，但仍需要大量高質(zhì)量的臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證，為更好的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的證據(jù)和更優(yōu)的聯(lián)合策略。因而，發(fā)掘更多的特異性分子診斷標(biāo)記物并加以驗(yàn)證，充分利用這些標(biāo)記物的優(yōu)勢，取長補(bǔ)短，為肝癌的臨床診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷等服務(wù)，仍是當(dāng)前一段時(shí)間臨床研究的重要方向。