范華穎 張家艷 方怡 高陽

近年來惡性腫瘤成為威脅人類健康的主要疾病之一，其中肺癌已成為我國發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是患病比例最高的肺癌類型，約占肺癌患者的90%[1-2]。隨著臨床檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物檢測已成預(yù)測腫瘤發(fā)生、診斷及腫瘤治療效果監(jiān)測的有效參考指標(biāo)[3]。腫瘤型丙酮酸激酶（tumor M2 pyruvate kinase，M2-PK）和烯醇化酶-α（enolase-α，ENO1）是細(xì)胞進(jìn)行有氧糖酵解途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[4-5]，其在多種腫瘤細(xì)胞中存在明顯的異常高表達(dá)現(xiàn)象，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義[6-7]。但關(guān)于M2-PK和ENO1在NSCLC患者肺癌組織中的表達(dá)，以及對患者生存期預(yù)測的研究少有報(bào)道。因此，本文以NSCLC患者為研究對象，探討肺癌患者肺癌組織中M2-PK和ENO1的表達(dá)水平與患者臨床病理分級及對患者生存期的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月至2013年6月間本院收治，經(jīng)病理學(xué)檢查確診的182例NSCLC患者。研究組中男性108例，女性74例，患者年齡32～75歲，平均（49.18±9.67）歲，其中鱗癌128例，腺癌54例；腫瘤分期結(jié)果（Tumor Node Metastasis，TNM）：Ⅰ期32例；Ⅱ期58例，Ⅲ期52例，Ⅳ期40例；高分化87例，低分化95例；其中淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移患者87例；浸潤深度T1和T2共97例，T3和T4共85例。對照組選擇68例同期醫(yī)院就診的肺良性病變患者，男性35例，女性33例，患者年齡31～74歲，平均（48.68±9.52）歲，疾病類型為慢性支氣管炎32例，支氣管擴(kuò)張22例，肺結(jié)核14例。2組入選患者年齡、性別等信息資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

肺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]確診為NSCLC患者；入院治療前未接受放療、化療、手術(shù)和靶向藥物等治療；術(shù)前均存在可測量病灶，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者存在腫瘤轉(zhuǎn)移或患有其他腫瘤；合并有其他器官功能異常及嚴(yán)重心血管疾?。换加邢忍煨苑喂δ墚惓；蚧位颊?。肺良性病納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)醫(yī)院診斷確診為慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核的患者；無其他重大疾病患者；近3個(gè)月未發(fā)生嚴(yán)重感染患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者存在其他腫瘤；肺部存在嚴(yán)重感染或損傷。所有入選對象均簽署知情同意書，自愿參與本課題研究。

1.2 材料與方法

1.2.1 試劑及儀器

兔抗人ENO1抗體購自美國Proteintech Group公司，貨號：55237-1-AP；兔抗人M2-PK抗體購自中國北京博奧森有限公司，貨號：bs-0101R；圖像采集成像系統(tǒng)（chemiDocTm）及圖像分析系統(tǒng)（Quantity One 1-D分析軟件）購自美國Bio-Rad Laboratories公司。

1.2.2 免疫組化分析

將患者進(jìn)行病理學(xué)診斷時(shí)獲得的病理組織由石蠟包埋后連續(xù)切片，固定于載玻片上，50℃烘箱中烘1h后，二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及75%乙醇依次進(jìn)行水化，蒸餾水洗滌3次，然后置于檸檬酸鈉溶液中加熱2次，每次8min，PBS洗滌3次，3%H2O2溶液中浸10min，PBS洗滌3次后，滴加ENO1抗體和M2-PK抗體稀釋液，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次后用羊抗兔二抗室溫孵育1h，PBS洗滌3次，免疫組化染色，蘇木精復(fù)染，0.1%HCl分化，藍(lán)化，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.3 數(shù)據(jù)對比分析

免疫組化結(jié)果評估由兩名專業(yè)病理人員采用雙盲法進(jìn)行判定，每張組織切片高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野區(qū)，每個(gè)視野區(qū)計(jì)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)M2-PK蛋白和ENO1蛋白定位結(jié)果，進(jìn)行結(jié)果分析，結(jié)果一致則記錄結(jié)果；不一致則由2人相同意見或第3位更加權(quán)威的醫(yī)師確定。其中M2-PK定位與胞漿或胞核，ENO1定位與胞漿或胞膜。陽性結(jié)果判讀采用免疫組化半定量分析，陽性細(xì)胞比例評定＞5%患者檢測為陽性[8-9]。

1.2.4 隨訪及信息統(tǒng)計(jì)

所有患者以門診、住院復(fù)查的方式由主治醫(yī)師定期隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者治療方案、復(fù)查信息、肺部電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢測、生存信息統(tǒng)計(jì)等。時(shí)間起始于患者入院治療，隨訪5年，統(tǒng)計(jì)患者5年內(nèi)的存活情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，對于服從正態(tài)分布的連續(xù)型資料，計(jì)量資料以（）表示表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織中M2-PK和ENO1的表達(dá)

M2-PK在在肺良性病變組織中的陽性表達(dá)22例，陽性率為32.36%；在肺癌組織中陽性表達(dá)142例，陽性率為78.02%，顯著高于肺良性病變患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ENO1在肺良性病變組織中的陽性表達(dá)20例，陽性率為29.41%；在肺癌組織中陽性表達(dá)123例，陽性率為67.58%，顯著高于肺良性病變患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 M2-PK、ENO1在肺良性病變組織和肺癌組織中的表達(dá)[n（%）]Table1 Expression of M2-PK and ENO1in benign lung lesions tissues and lung cancer tissues[n（%）]

圖1 M2-PK、ENO1在肺組織中的免疫組化分析（×40）Figure1 Immunohistochemicalanalysis of and in lung tissues（×40）

2.2 肺癌組織中M2-PK、ENO1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

分析患者的臨床病理特征與肺癌組織中ENO1、M2-PK表達(dá)，結(jié)果顯示，肺癌組織中ENO1、M2-PK表達(dá)與肺癌的分化程度、浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與患者的年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 M2-PK、ENO1表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table2 Relationship between expression ofM2-PK and ENO1and clinicopathological features of lung cancer[n（%）]

2.3 肺癌組織中M2-PK、ENO1表達(dá)相關(guān)性

肺癌組織中共111例M2-PK、ENO1共陽性表達(dá)，28例M2-PK、ENO1共陰性表達(dá)，M2-PK單陽性31例，ENO1單陽性12例，相關(guān)性分析結(jié)果顯示M2-PK與ENO1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.769，P＜0.05）。

2.4 肺癌組織中M2-PK和ENO1高表達(dá)與患者生存期的關(guān)系

陽性細(xì)胞比例達(dá)50%以上為高表達(dá)，不表達(dá)或低于50%為低表達(dá)，分析2種蛋白高、低表達(dá)對患者5年生存的影響，結(jié)果顯示，M2-PK陽性細(xì)胞比例≥50%共83例，患者5年存活31例，存活率為37.35%；M2-PK低表達(dá)99例，患者5年存活62例，存活率為62.62%，顯著高于M2-PK高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ENO1陽性細(xì)胞比例≥50%共65例，患者5年存活21例，存活率為32.31%；ENO1低表達(dá)117例，患者5年存活62例，存活率為52.99%，顯著高于ENO1高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 肺癌組織中M2-PK、ENO1高表達(dá)與患者生存期的關(guān)系

選擇ENO1和M2-PK共表達(dá)的111例患者為研究對線，2種蛋白陽性細(xì)胞比例均在50%以上為共高表達(dá)，均低于50%為低表達(dá)，分析2種蛋白高表達(dá)對患者5年生存率的影響，結(jié)果顯示，M2-PK和ENO1共高表達(dá)患者52例，5年存活患者15例，存活率為28.8 4%；共低表達(dá)患者59例，5年存活患者35例，存活率為59.32%，顯著高于M2-PK和ENO1共高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 肺癌組織中M2-PK、ENO1高表達(dá)與患者5生存期的關(guān)系Figure2 Relationship between high expression of M2-PK and ENO1and 5-year survival time in lung cancer tissues

3 討論

M2-PK是丙酮酸激酶的一種同工酶，對三磷酸腺苷的合成起著重要作用，當(dāng)M2-PK以二聚體存在時(shí)主要調(diào)節(jié)機(jī)體碳水化合物的合成轉(zhuǎn)態(tài)；以四聚體形式存在時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體糖酵解的產(chǎn)能狀態(tài)[9]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，初始組織特異性的丙酮酸激酶會逐漸被M2代替，并以二聚體形式存在于腫瘤細(xì)胞中，促使和增強(qiáng)腫瘤糖酵解途徑，在腫瘤細(xì)胞增殖與代謝過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)正常人血清中M2-PK水平很低，而在腫瘤患者血清中顯著升高，臨床顯示其在肺癌、乳腺癌、宮頸癌等實(shí)體腫瘤的診斷中具有重要作用[12-13]。在黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn)，M2-PK水平不僅與患者的臨床分期有關(guān)，同時(shí)而還能在預(yù)測患者生存預(yù)后發(fā)揮重要價(jià)值[14]。

ENO1是一種高度保守磷酸烯醇化酶，該蛋白在胞漿中的表達(dá)主要作用是參與細(xì)胞的糖酵解途徑發(fā)揮催化作用，促進(jìn)磷酸化烯醇式丙酮酸的形成[15]，參與體內(nèi)多種生物學(xué)活動(dòng)，如低氧耐受及炎癥反應(yīng)。此外許多報(bào)道表明，ENO1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中存在異常高表達(dá)現(xiàn)象[16]。Yu等[17]人的研究發(fā)現(xiàn)ENO1可以作為早期肺癌診斷標(biāo)志物。在非小細(xì)胞肺癌中，ENO1能夠通過抑制ERK的磷酸化抑制肺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18]。在對前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，ENO1能夠刺激血纖維蛋白溶酶體受體的活化促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[17]，而腫瘤的侵襲和簽署是患者治療和預(yù)后的重要因素[19]。

由于腫瘤細(xì)胞在快速增殖過程中的能量代謝主要依賴于葡萄糖的糖酵解途徑，M2-PK和ENO1作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。此外，在實(shí)體腫瘤組織中，由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，往往會造成組織處于低氧狀態(tài)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的糖酵解途徑[20-21]，在對M2-PK、ENO1的基因研究發(fā)現(xiàn)，兩者的啟動(dòng)區(qū)均存在缺氧反應(yīng)原件；同時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而ENO1在細(xì)胞表面的高表達(dá)能夠增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。本文對NSCLC患者肺癌癌組織中表達(dá)水平分析顯示，M2-PK、ENO1肺癌組織中陽性率顯著高于肺良性病變患者（P＜0.05）；與Yu等[22]和Kobierzycki等[23]的關(guān)于M2-PK、ENO1在NSCLC患者中的表達(dá)結(jié)果一致。

研究證實(shí)由于M2-PK和ENO1蛋白能夠通過腫瘤細(xì)胞的壞死與細(xì)胞更新，分泌到細(xì)胞外，其表達(dá)水平只與腫瘤的病征有關(guān)。本文對2種蛋白的表達(dá)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)與Gu等[23]的研究結(jié)果一致，這可能與兩者均為糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶有關(guān)。同時(shí)本文也首次研究患者治療前M2-PK和ENO1共表達(dá)水平與患者5年存活率的關(guān)系，結(jié)果顯示M2-PK和ENO1高表達(dá)患者的5年存活率均顯著低于M2-PK和ENO1低表達(dá)患者（P＜0.05），其原因可能是M2-PK和ENO1高表達(dá)水平預(yù)示著腫瘤細(xì)胞處于較高的增殖活性，患者的腫瘤分化差、晚期患者比例高、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高，治療難度大，不利于患者的預(yù)后和長期生存[25]。

綜上所述，肺癌組織中M2-PK、ENO1的高水平表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)測患者的生存期有一定指導(dǎo)意義。