喬金平 胡文君 陳薇 劉慧 張小鵬 代雅倩 彭麗朵 徐元宏 方慧琴★ 袁靜★

出生缺陷在我國(guó)的發(fā)生率約5.6%，而以染色體數(shù)目異常、大片段缺失或重復(fù)及致病性基因組致病性拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation，CNV）等為主的染色體畸變約占出生缺陷的遺傳學(xué)病因的80%以上[1-2]。染色體核型分析技術(shù)（下文簡(jiǎn)稱為核型分析），是染色體疾病確診的金標(biāo)準(zhǔn)之一，但需要細(xì)胞培養(yǎng)，存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、通量低、分辨率較低（無法檢出5Mb以下的CNV）等諸多不足，已無法滿足日益增長(zhǎng)的產(chǎn)前診斷需求[2]?；诘蜕疃热蚪M測(cè)序的基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序（Copy Number Variation Sequencing，CNV-seq）技術(shù)由于其具有檢測(cè)覆蓋面廣、通量高、易操作、所需DNA樣本量低等諸多優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于包括非整倍體、微缺失、微重復(fù)等在內(nèi)的染色體畸變的檢測(cè)[1]?；诙檀?lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR）為核心的定量熒光PCR（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QF-PCR）技術(shù)具有通量高、速度快（可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)并出具報(bào)告）、可檢測(cè)母血污染、準(zhǔn)確性高[能診斷出99.2%～100.0%目標(biāo)染色體（21、18、13、X和Y共5種染色體）的非整倍體異常][3-4]等特點(diǎn)。結(jié)合各自的優(yōu)勢(shì)和互補(bǔ)性，QF-PCR和CNV-seq的聯(lián)合使用可用于替代核型分析已成為專家共識(shí)[1]，因此這兩種技術(shù)的聯(lián)合使用已逐漸普及，為有產(chǎn)前診斷需求的人群，特別是無法做核型培養(yǎng)的人群提供了較好的選擇。本研究通過對(duì)比分析本院106例QF-PCR聯(lián)合102例CNV-seq及4例核型分析的檢測(cè)情況，探討這些技術(shù)在染色體畸變?cè)\斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值及聯(lián)合檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年5月至2019年9月因高齡、血清學(xué)唐氏篩查異常、B超異常或無創(chuàng)產(chǎn)前檢查（Noninvasive Prenatal Testing，NIPT）高風(fēng)險(xiǎn)等來本院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，均對(duì)其進(jìn)行各種產(chǎn)前診斷方法的介紹，填寫知情同意書、自愿選擇相應(yīng)的檢測(cè)。105位孕婦，共抽取羊水106例（1例為雙胎），其中CNV-seq（102例）、核型分析（4例），所有106例樣本均同時(shí)進(jìn)行了QF-PCR檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器

21、18、13及性染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（熒光PCR毛細(xì)管電泳法）購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司以及廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，甲酰胺、Liz600、ABI3500DX測(cè)序儀和Gene-Mapper5.0軟件均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，K5800微量分光光度計(jì)購(gòu)自北京凱奧公司。

1.3 方法

1.3.1 羊水QF-PCR檢測(cè)

在檢驗(yàn)科分子診斷室，使用核酸提取和QF-PCR試劑盒，大體步驟如下。羊水DNA提取：取1.9mL羊水離心去上清，沉淀使用核酸提取試劑盒提取羊水基因組DNA，K5800微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，-20℃保存；QF-PCR檢測(cè)分析：前89例采用達(dá)安試劑盒（15個(gè)STR位點(diǎn)），后17例采用達(dá)瑞試劑盒（20個(gè)STR位點(diǎn)）；PCR擴(kuò)增均參照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書；擴(kuò)增后取1μL PCR產(chǎn)物和13.5μL甲酰胺、0.5μLLiz600混合，ABI3500DX進(jìn)行片段分析，GeneMapper 5.0分析數(shù)據(jù)。

1.3.2 羊水CNV-seq檢測(cè)

本檢測(cè)抽取待檢孕婦的羊水和抗凝全血交由湖南家輝遺傳專科醫(yī)院進(jìn)行檢測(cè)，參照文獻(xiàn)中的方法[5]，大體步驟如下：提取羊水DNA，限制性內(nèi)切酶水解獲得平均大小為200bp的DNA片段，采用PCR-free方法制備文庫(kù)（北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司），連接接頭，在NextSeq CN500高通量測(cè)序平臺(tái)，36 bp單端測(cè)序，測(cè)序深度0.1X。所有測(cè)定序列，通過平行比對(duì)軟件與hg19人類基因組進(jìn)行完全比對(duì)分析。以100kb為基本分析單元，將人類基因組劃分為若干個(gè)連續(xù)區(qū)域，統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)域內(nèi)樣本完全匹配的uniq reads序列數(shù)。采用專用算法判讀樣本的CNV，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)序拷貝數(shù)為y軸，以每條染色體連續(xù)的100kb分析單元為x軸，繪制CNV-seq檢測(cè)結(jié)果圖，判斷待測(cè)樣本的染色體情況。通過檢索CNV比對(duì)常用數(shù)據(jù)庫(kù)最新公布數(shù)據(jù)進(jìn)行CNV臨床意義的確定[5]。

1.3.3 羊水染色體核型分析

在本院產(chǎn)前診斷中心，按常規(guī)方法對(duì)10mL羊水離心，取沉淀中的羊水細(xì)胞培養(yǎng)，制備染色體G顯帶，參照ISCN（2016）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。

2 結(jié)果

2.1 QF-PCR與CNV-seq及染色體核型分析結(jié)果的對(duì)比

將QF-PCR測(cè)定的核型正常作為陰性，異常作為陽(yáng)性，在21、18、13、X、Y共5種染色體（下文中均簡(jiǎn)稱為5種染色體）的非整倍體檢測(cè)方面，QF-PCR與CNV-seq和染色體核型對(duì)比，依據(jù)QF-PCR測(cè)得的核型分，結(jié)果如下：46XX QF-PCR 43例，CNV-seq符合42例，核型分析符合1例，符合率均為100%；46XY QF-PCR 49例，CNV-seq符合48例，核型分析符合1例，符合率均為100%；47XX+18 QF-PCR3例，CNV-seq符合2例，核型分析符合1例，符合率均為100%；47XY+18 QF-PCR1例，CNV-seq符合1例，符合率為100%；47XX+21QF-PCR6例，CNV-seq符合5例，核型分析符合1例，符合率均為100%；47XXY QF-PCR3例，CNV-seq符合3例，符合率為100%；47XYY QF-PCR1例，CNV-seq符合1例，符合率為100%。因此，QF-PCR與CNV-seq及核型分析的陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率均為100%。

2.2 CNV-seq陽(yáng)性，但QF-PCR無法檢出的標(biāo)本統(tǒng)計(jì)

CNV-seq檢出陽(yáng)性但QF-PCR無法檢出的共21例，其中，CNV多態(tài)性7例，致病性未知3例，明確致病11例，見表1。

2.3 CNV-seq檢出陽(yáng)性，但染色體核型無法檢出的標(biāo)本統(tǒng)計(jì)

CNV-seq檢出陽(yáng)性，而QF-PCR無法檢出的標(biāo)本共21例，其中1例2號(hào)染色體q33.1-q37.3處重復(fù)39.48Mb，染色體核型是能檢測(cè)的，其余20例標(biāo)本的微缺失或微重復(fù)均小于4Mb，未達(dá)到染色體核型的分辨率（5Mb），見表1。

表1 CNV檢出陽(yáng)性，但QF-PCR無法檢出的標(biāo)本統(tǒng)計(jì)Table1 The specimen（CNV detected positive，butQF-PCR could notdetect）statistics

3 討論

本研究由于病例數(shù)較少，所以各種方法比較時(shí)所得的陽(yáng)性符合率只能部分提示該方法的真實(shí)能力。

在本研究中，在5種染色體非整倍體檢測(cè)方面，QF-PCR與CNV-seq及核型分析相比，結(jié)果完全一致，提示QF-PCR作為產(chǎn)前診斷項(xiàng)目，其準(zhǔn)確性符合要求，這和指南及文獻(xiàn)是一致的[3-4]。

在全部染色體檢測(cè)方面，本研究中，除CNVseq多態(tài)性外，CNV-seq陽(yáng)性但QF-PCR無法檢出的14例標(biāo)本如果未做CNV-seq，而只做QF-PCR，可能就全部漏診了，文獻(xiàn)也報(bào)道了類似的情況[6-7]。上述結(jié)果也部分提示產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)本發(fā)生CNV-seq異常的可能性也許會(huì)更高，例如唐篩21三體陽(yáng)性的孕婦在只做QF-PCR驗(yàn)證是否為21三體的同時(shí)，應(yīng)同時(shí)選擇CNV-seq或核型分析排除其他染色體的異常。

雖然核型分析是目前染色體疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一，但其分辨率較低，為5Mb左右，因此本研究中，除了兩例21三體陽(yáng)性合并其他染色體微缺失的，其他18例如果只做核型分析，很可能均無法檢出，而這其中，CNV-seq陽(yáng)性且明確致病的有9例。此結(jié)果顯示了CNV-seq較之核型分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，QF-PCR技術(shù)準(zhǔn)確性高、速度快，可大大縮短報(bào)告的等待時(shí)間，緩解孕婦及家屬的焦慮情緒。但由于其局限性，在產(chǎn)前診斷時(shí)，需要和CNV-seq或核型分析等聯(lián)合檢測(cè)，這樣才能更好的發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)。CNV-seq作為覆蓋面廣的產(chǎn)前診斷，也其必須使用QF-PCR進(jìn)行母體細(xì)胞污染鑒別。因此，QF-PCR和CNV-seq聯(lián)合檢測(cè)具有速度快、通量高、覆蓋廣的優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為產(chǎn)前診斷的一線方法。