灑玉萍，張廣梅，趙協(xié)慧，王樹林，李菊英，武 娟

(青海大學(xué)，青海 西寧 810001)

伴隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程，有報(bào)道稱我國老齡人口預(yù)計(jì)到本世紀(jì)中葉，將達(dá)到2.5億，可能患有骨質(zhì)疏松癥(OP)的概率為25%～70%[1]。針灸對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域的臨床研究報(bào)道較多，機(jī)理研究尚顯不夠完善和系統(tǒng)，尚未見不同治療方法之間的比較。本實(shí)驗(yàn)采用去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型進(jìn)一步觀察針灸抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用機(jī)理，初步比較毫針針刺和穴位注射不同方法的作用，對于針灸臨床防治骨質(zhì)疏松癥提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡、體質(zhì)量(200±20)g SD未孕雌性大鼠32只，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：NO62001000000326。

1.1.2 主要試劑與儀器 血清抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5,批號(hào)L170904287)、骨堿性磷酸酶(ALP，批號(hào)L170904292)、血清骨鈣素(BPG,批號(hào)L170803331)均購自武漢公司;骨肽注射液由安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)170530，規(guī)格是2 mL∶10 mg×10支)。多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：Infinite M200，瑞士);高速離心機(jī)(型號(hào)：TG16-WS,湖南湘儀)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 SD大鼠適應(yīng)1周，清潔級(jí)-架式分籠-標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。隨機(jī)分為空白對照組8只和造模組24只。具體方法按照前期試驗(yàn)方法，進(jìn)行大鼠模型制備[2]。摘除卵巢后5 d，逐只進(jìn)行陰道檢查，每天1次，連續(xù)5 d，無動(dòng)情周期變化，證明去勢成功。

模型成功建立后，將其隨機(jī)分為模型組、針刺組與穴位注射組，每組各8只。

1.2.2 干預(yù)方法 穴位選擇：懸鐘、腎俞(均為雙側(cè))，分別進(jìn)行毫針針刺與穴位注射干預(yù)。取穴依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》定位。

干預(yù)方法：造模成功后1個(gè)月開始處理。針刺組：選用0.35 mm×25 mm毫針，皮膚常規(guī)消毒，進(jìn)針后用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法1 min，不留針，1次/d，10次一療程；穴位注射組：皮膚常規(guī)消毒后，選用一次性注射器，型號(hào)：1 mL，抽取骨肽注射液，回抽無血后注射藥物，0.2 mL/穴，隔天1次，5次為一療程；療程間隔2 d，共5個(gè)療程；空白組和模型組僅施行相同的捉抓刺激。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束、禁食12 h后取材。用10%水合氯醛按0.1 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉后取材。腹主動(dòng)脈取血，離心3 000 r/min，取上清液，用移液器分別移入已備好的0.5 mLEp管中，標(biāo)記后置于-80℃保存待測，其中對照組2只大鼠麻醉后采血時(shí)死亡，取血失敗。骨組織形態(tài)觀察：取大鼠左側(cè)股骨，經(jīng)4%組織固定液固定,石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察骨組織形態(tài)。免疫酶聯(lián)法測定血清抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5)、骨堿性磷酸酶(ALP)和血清骨鈣素(BGP)含量，嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨組織形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 空白組 皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)致密，骨髓腔中充滿大量正常的骨髓細(xì)胞。骨小梁的連接正常，有破骨細(xì)胞，骨膜清晰，骨密質(zhì)層次正常。見圖1A。

2.1.2 模型組 骨小梁結(jié)構(gòu)正常，骨小梁彌漫變細(xì)、斷裂，骨髓腔中充滿大量正常的骨髓細(xì)胞。見圖1B。

2.1.3 針刺組 骨小梁結(jié)構(gòu)正常，骨小梁部分區(qū)域仍有變細(xì)、斷裂(較模型組有改善)，骨髓腔中充滿大量正常的骨髓細(xì)胞。見圖1C。

2.1.4 穴位注射組 骨小梁結(jié)構(gòu)正常，骨小梁少部分區(qū)域仍有變細(xì)、斷裂(較模型組有明顯改善)，骨髓腔中充滿大量正常的骨髓細(xì)胞，骨小梁內(nèi)形成板層結(jié)構(gòu)。見圖1D。

2.2 毫針針刺與穴位注射對各組大鼠骨代謝水平的影響

模型組大鼠的血清ACP5較空白組顯著升高(P<0.01)。經(jīng)毫針針刺和穴位注射干預(yù)后，與模型組比較,兩組大鼠的血清ACP5含量均明顯降低(P<0.05)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

注：A為空白組，B為模型組，C為針刺組，D為穴位注射組。 圖1 骨組織形態(tài)學(xué)觀察(100×)

表1 針刺、穴位注射對ACP5、ALP和BPG影響的表達(dá)

模型組大鼠的血清ALP較空白組顯著下降(P<0.01)。經(jīng)毫針針刺和穴位注射干預(yù)后，兩組大鼠的血清ALP含量均明顯升高,與模型組比較P<0.01，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

模型組大鼠的血清BPG較空白組顯著降低(P<0.01)。毫針針刺和穴位注射干預(yù)后，兩組大鼠的血清BPG含量均明顯升高(與模型組比較P<0.05)，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 大鼠血清性激素變化比較

與空白組比較，模型組大鼠FSH顯著升高(P<0.05)，經(jīng)毫針針刺和穴位注射干預(yù)后FSH水平下降；針刺組和穴位注射組之間FSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組比較，模型組大鼠E2水平下降，經(jīng)毫針針刺和穴位注射干預(yù)后E2升高，但各組之間E2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清E2、FSH結(jié)果

3 討論

伴隨老齡化社會(huì)發(fā)展，OP是我國民眾面臨的重要健康問題，且隨著年齡增長OP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)，表現(xiàn)為以進(jìn)行性骨丟失、骨脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的全身性疾病，屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，形成與停經(jīng)后卵巢分泌雌激素水平低下，進(jìn)而骨吸收功能強(qiáng)與骨形成功能有關(guān)。研究顯示，我國50歲以上女性O(shè)P患病率為20.7%，男性為14.4%，發(fā)病率呈增長趨勢[3]。去除卵巢造成的骨質(zhì)疏松癥模型可以很好模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，一般認(rèn)為腎虛是其病機(jī)關(guān)鍵。因?yàn)槁殉补δ芩ネ艘鹦约に厮降牟▌?dòng)，可出現(xiàn)脂肪代謝與分布異常、體質(zhì)量增加為表現(xiàn)的肥胖[4]。而研究發(fā)現(xiàn)針刺可改善下丘腦-垂體-卵巢軸、植物神經(jīng)功能及血管舒縮功能，糾正能量代謝紊亂[5]，進(jìn)而提高卵巢功能。中醫(yī)古籍中，雖無骨質(zhì)疏松癥的病名，但其臨床表現(xiàn)和中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”“骨痹”相似。腎被稱為“先天之本”，腎精腎氣的充盈直接影響骨的生長和發(fā)育。認(rèn)為腎主骨生髓，若腎虛則骨髓化源不足，骨骼失養(yǎng)就會(huì)脆弱無力，患者可以出現(xiàn)腰酸腿軟、骨骼疼痛、頭暈?zāi)垦：瓦z精盜汗等臨床表現(xiàn)，可見腎虛是骨質(zhì)疏松癥病機(jī)的關(guān)鍵[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)中去卵巢后模型大鼠血清FSH、E2的變化與人類絕經(jīng)期激素水平變化吻合，表現(xiàn)為FSH水平的上升、E2水平的降低。且另有研究隨著性激素的改變，出現(xiàn)大鼠體質(zhì)量上升，子宮萎縮，其重量和指數(shù)降低，經(jīng)針刺與穴位注射腎俞穴、懸鐘穴后，表現(xiàn)為大鼠的體質(zhì)量下降,與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),子宮的重量及指數(shù)增加,與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且毫針針刺及穴位注射干預(yù)后大鼠血清FSH水平下降、E2水平升高，對大鼠性激素有調(diào)節(jié)作用，但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

ALP是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志之一，可以從ALP 的活性看出成骨細(xì)胞的活躍狀況[8]。ACP5 的活性反映骨吸收的能力，而血清中BPG的水平可以反映成骨細(xì)胞的活動(dòng)，也可反映骨吸收作用[9]，其濃度與骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，通過對大鼠骨形態(tài)學(xué)變化觀察發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組的骨小梁彌漫變細(xì)、斷裂,且模型組的ACP5水平明顯升高、ALP與BPG含量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明骨吸收活躍而骨形成減弱，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨轉(zhuǎn)換率增高的特點(diǎn)吻合，說明去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型建立成功。經(jīng)毫針針刺和穴位注射干預(yù)后 ACP5水平下降、ALP與BPG水平升高,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。光鏡下觀察大鼠股骨形態(tài)，毫針針刺組和穴位注射組仍可見骨小梁變細(xì)、斷裂，但程度較模型組改善。說明毫針針刺和穴位注射腎俞、絕骨二穴均可調(diào)節(jié)去卵巢大鼠ALP、ACP5和BPG水平(P<0.05)，改善骨組織形態(tài)，具有益髓壯骨作用。

懸鐘穴是八會(huì)穴之髓會(huì)。骨者髓之府，骨者髓所養(yǎng)，髓藏于骨中并充養(yǎng)骨骼，因此懸鐘穴可以補(bǔ)髓壯骨，治療骨痿、腰酸脛軟等病癥。腎俞是腎的臟腑經(jīng)氣輸注到背腰部的特定位置，可以補(bǔ)腎填精壯腰，善于治療臟腑疾患[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毫針針刺、穴位注射懸鐘穴、腎俞穴可通過疏肝補(bǔ)腎、益髓壯骨作用對去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的生殖內(nèi)分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)，并對骨代謝有一定調(diào)節(jié)作用。

針灸作為綠色療法，在緩解骨質(zhì)疏松引起的腰背肌肉疼痛、疲勞等慢性病癥的同時(shí)，無服用藥物引發(fā)胃腸道不適等不良反應(yīng)，并且有良好的臨床療效[11-12]，本實(shí)驗(yàn)可為針灸臨床預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥提供參考。