陳 毅，鄔 俊，王 貴，李 雙，王唯婷，李學(xué)濤，王曉波*

（1.大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第967 醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116021）

在全球范圍內(nèi)男性癌癥患者中，肺癌是僅次于前列腺癌的第二大常見(jiàn)癌癥。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的80%，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，患者的5 年生存率很低[1-2]，且部分患者已經(jīng)發(fā)生了癌癥轉(zhuǎn)移。

R8（八精氨酸）是一種細(xì)胞穿膜肽，是一種能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的短肽，能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)大分子的攝取[3]。鹽酸柔紅霉素（Daunorubicin，DNR）是一種在白血病治療中比較常見(jiàn)的藥物，但是因患者對(duì)DNR 較易產(chǎn)生耐藥性和其強(qiáng)烈的骨髓抑制、心臟毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)，使得該藥物的使用受到一定限制。和厚樸酚（Honokiol，HNK）是中藥厚樸干皮中的一種聯(lián)苯二酚類(lèi)化合物，已有研究表明HNK 能夠通過(guò)下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)和上調(diào)上皮標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，HNK 具有下調(diào)多種基質(zhì)金屬蛋白酶的作用[4]。但上述兩種藥物都有半衰期短、口服生物利用度低等缺點(diǎn)，由于兩種藥物都有較好的抗腫瘤活性，因此可以通過(guò)嘗試改變藥物在體內(nèi)的傳遞方式來(lái)解決其中的一些問(wèn)題。藥物遞送的最終目標(biāo)是通過(guò)在特定作用部位釋放有效藥物成分來(lái)提高生物利用度并減少其毒副作用。近年來(lái)，脂質(zhì)體一直是劑型開(kāi)發(fā)中較為重視的藥物遞送系統(tǒng)之一[5]，脂質(zhì)體可以將各種活性化合物封裝在其脂質(zhì)雙層或親水性核心中。若以一些特定的配體進(jìn)行修飾，既可以提高藥物的腫瘤靶向性，也可以增加生物利用度，減小藥物的副作用[6]。本研究制備了R8穿膜肽修飾的DNR/HNK 脂質(zhì)體，并對(duì)制備的脂質(zhì)體能否有效的被攝取以及該脂質(zhì)體的體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行研究，以期為藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與試劑

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）獲得于中科院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海）。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10 %胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.） 和 100 U/mL青霉素和100μg/mL 鏈霉素（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.） 的DMEM（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.）的完全培養(yǎng)基中。長(zhǎng)鏈二烷基羰花青化合物（DiR，KGMP0026）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；鹽酸柔紅霉素（DNR，MB1074-2）和厚樸酚（HNK，MB5989-2）購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司；DSPE-PEG2000-R8（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室合成并提供）。

YA1071 透析袋（北京索萊寶科技有限公司）；Mastersizer3000 激光粒徑測(cè)定儀（英國(guó)Malvern 公司）；葡聚糖凝膠SephadexG-50 柱（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 的ELISA 試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；卵磷脂（L8260，北京索萊寶科技有限公司）；膽固醇（C8280，北京索萊寶科技有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水。

2 方法

2.1 脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)考察

2.1.1 脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法-硫酸銨梯度法[7]制備脂質(zhì)體。在圓底燒瓶中加入處方量的膽固醇4 mg、卵磷脂22 mg、DSPE-PEG2000 2 mg、DSPE-PEG2000-R81 mg、HNK 2 mg 與甲醇混勻，超聲使之溶解，在40 ℃水浴下減壓蒸發(fā)至形成一層薄膜，加入5 mL 250 mM/L（NH4）2SO4溶液并超聲處理使薄膜溶解，然后將其轉(zhuǎn)移至10 mL EP 管中，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)超聲10 min（500 W），混懸液用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾兩次，隨后轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量12 000 ～ 14 000 Da）在PBS溶液中透析24 h，每8 h 更換一次PBS。

在圓底燒瓶中加入處方量的DNR 1 mg 與上述透析完成的脂質(zhì)體于40 ℃水浴中振搖20 min，即得R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體。處方中不加入DNR/HNK，其余操作步驟同上，即得R8-空白脂質(zhì)體。處方中不加入DSPE-PEG2000-R8，其余操作步驟同上，即得DNR/HNK 脂質(zhì)體。處方中不加入DSPE-PEG2000-R8和HNK，其余操作步驟同上，即得DNR 脂質(zhì)體。處方中不加入DSPE-PEG2000-R8和DNR，超聲破碎機(jī)超聲完畢即得HNK 脂質(zhì)體。

2.1.2 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定 取500 μL R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體至凝膠柱上方，加入PBS 進(jìn)行洗脫，當(dāng)液體出現(xiàn)紅色時(shí)開(kāi)始用5 mL 容量瓶收集，直至紅色完全流出即收集完畢。向容量瓶中加入PBS 緩沖液定容至5 mL，混勻。精密吸取500 μL 于EP 管中，再加入等體積甲醇溶液破乳。按照各自色譜條件分別測(cè)定溶液中DNR 和HNK 濃度，并分別計(jì)算脂質(zhì)體中兩種藥物的含量。

另取500 μL R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體至5 mL 容量瓶中，用PBS 定容。精密吸取500 μL 于EP 管中，再加入等體積甲醇溶液破乳。按照HPLC 條件分別測(cè)定溶液中DNR 和HNK 濃度，并分別計(jì)算兩種藥物總含量。根據(jù)如下公式分別計(jì)算脂質(zhì)體中DNR 和HNK 的包封率：包封率（%） =W1/W0× 100%。其中，W1為脂質(zhì)體中藥物含量，W0為總藥物含量。

2.1.3 脂質(zhì)體的理化性質(zhì)表征 吸取制備的脂質(zhì)體溶液適量，以PBS 溶液稀釋50 倍。取稀釋后的脂質(zhì)體溶液適量，滴加至專(zhuān)用銅網(wǎng)上，以用體積分?jǐn)?shù)為2%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干，然后置于透射電子顯微鏡上（加速電壓：120 kV）觀察其形態(tài)[8]。

采用激光散射粒徑測(cè)定儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑等指標(biāo)，取脂質(zhì)體溶液200 μL，使用激光散射粒徑測(cè)定儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑及Zeta 電位（每次設(shè)定循環(huán)10 次）[9]。

2.2 細(xì)胞活力測(cè)定

A549 細(xì)胞在96 孔板（2 × 104個(gè)/孔）中37℃孵育箱過(guò)夜，并用R8-空白脂質(zhì)體、DNR 脂質(zhì)體、HNK脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體分別處理細(xì)胞48 h（使得各組柔紅霉素終濃度為1.093 75、2.187 5、4.375、8.75、17.5、35 和70 μM/mL）。每孔共加入20 μL CCK8，將96 孔板于37°C 再培養(yǎng)3 h 后在酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%） =OD給藥組/OD空白對(duì)照組× 100%。結(jié)果使用 Graphpad-Prism-5 軟件計(jì)算各組脂質(zhì)體的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 傷口愈合測(cè)定

A549 細(xì)胞在6 孔板（6 × 105個(gè)/孔）中37℃孵育箱過(guò)夜，待其生長(zhǎng)融合至80% ～ 90%，用200 μL移液器吸頭在孔中小心地劃出一個(gè)傷口，棄去完全培養(yǎng)基，然后用 PBS 清洗兩次以除去漂浮細(xì)胞。分別加入DNR 脂質(zhì)體、HNK 脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，使得體系中DNR 終濃度為7 μM/mL，HNK 終濃度為17.5 μM/mL，空白對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基，各組在含有體積分?jǐn)?shù)為1%血清培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育24 h，使用倒置顯微鏡分別獲取0、12 和24 h 遷移圖像并分析。

2.4 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

A549 細(xì) 胞 在6 孔 板（6 × 105個(gè)/孔）中37 ℃孵育箱過(guò)夜，棄去完全培養(yǎng)基，然后用 PBS 清洗兩次，隨后胰酶消化，離心后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞使得Transwell 小室內(nèi)細(xì)胞為4 ×104個(gè)。分別加入DNR 脂質(zhì)體、HNK 脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，使得DNR 終濃度為7 μM/mL，HNK 終濃度為17.5 μM/mL，空白對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液與各組別脂質(zhì)體混合加入上室，使得上室體積為200 μL，下室添加700 μL 含有體積分?jǐn)?shù)為15% FBS 的培養(yǎng)基作為誘引劑。孵育箱中孵育48 h，用棉簽刮去上室沒(méi)有遷移的細(xì)胞，小室膜外側(cè)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%結(jié)晶紫室溫染色20 min，使用倒置顯微鏡獲取圖像。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 的表達(dá)

A549 細(xì)胞在6 孔板（6 × 105個(gè)/孔）中37 ℃孵育箱過(guò)夜，分別加入DNR 脂質(zhì)體、HNK 脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，使得DNR終濃度為7 μM/mL，HNK 終濃度為17.5 μM/mL，分別處理細(xì)胞24 h。用預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞，含有1%PMSF 的RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞總蛋白。使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各樣品蛋白濃 度。使 用MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 四 種ELISA檢測(cè)試劑盒來(lái)定量分析四種蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

2.6 體外攝取

使用流式細(xì)胞儀考察脂質(zhì)體在體外的攝取情況，將A549 細(xì)胞在6 孔板（5 × 105個(gè)/孔）中37℃孵育箱過(guò)夜，分別使用游離DNR（終濃度為7 μM/mL），DNR 脂質(zhì)體（終濃度為7 μM/mL），R8-DNR/HNK脂質(zhì)體（終濃度為7μM/mL）處理細(xì)胞1、2、3 h。棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗除去懸浮的細(xì)胞，用胰酶消化各孔細(xì)胞，離心棄去培養(yǎng)基，用PBS 重懸細(xì)胞，進(jìn)入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 體內(nèi)攝取

2.7.1 荷瘤小鼠模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞胰酶消化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5 × 106個(gè)細(xì)胞混懸于200 μL 生理鹽水中，小鼠腋下注射，繼續(xù)飼養(yǎng)10 d，每天觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體大小，待腫瘤體積達(dá)到90 mm3時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7.2 DiR 脂質(zhì)體的制備 采用活體成像實(shí)驗(yàn)考察脂質(zhì)體的體內(nèi)靶向性。將DNR 藥物替換為DiR，分別制備DiR 脂質(zhì)體和R8-DiR/HNK 靶向脂質(zhì)體，卵磷脂和DiR 的比例為200 ∶1（w/w），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備。

2.7.3 體內(nèi)攝取 當(dāng)荷瘤小鼠成功造模后，對(duì)各組荷瘤小鼠分別尾靜脈注射游離DiR、DiR 脂質(zhì)體和R8-DiR/HNK 脂質(zhì)體，空白對(duì)照給予生理鹽水，每組3 只。各給藥組的DiR 劑量均為2 μg/只。使用光學(xué)成像系統(tǒng)分別于給藥后1、3、6、12 和24 h對(duì)小鼠進(jìn)行熒光成像并觀察記錄。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體制備的最優(yōu)處方及理化性質(zhì)表征

運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法以及本實(shí)驗(yàn)室制備經(jīng)驗(yàn)[10]，確定脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為：卵磷脂22 mg、膽固醇4 mg、DNR 1 mg、HNK 2 mg、處方量為5 mL。根據(jù)最優(yōu)處方制備的脂質(zhì)體計(jì)算得DNR 平均包封率為（93.53 ± 0.17） %，HNK平均包封率為 （87.27 ± 0.58） %，兩藥平均包封率為（91.73 ± 0.11）%。符合2020 年版《中國(guó)藥典》（四部）對(duì)微粒制劑包封率不低于80%的要求。脂質(zhì)體的粒徑為（87.17 ± 1.19）nm（n= 3），Zeta 電位為（-2.0 ± 0.9）mV（n= 3）, 形態(tài)呈圓形，粒徑均一，分散均勻，結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.2 細(xì)胞活力測(cè)定

R8-空白脂質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞毒性，HNK 作為脂質(zhì)體調(diào)節(jié)劑，低濃度情況下對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒，DNR 脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性隨著劑量的加大而增大，R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體對(duì)A549 細(xì)胞的毒性最強(qiáng)，以脂質(zhì)體中DNR 濃 度 計(jì) 算，IC50為（9.79 ± 0.87）μM/mL；而DNR/HNK脂質(zhì)體的IC50為（11.57 ± 0.88） μM/mL。以上結(jié)果表明，R8修飾的脂質(zhì)體對(duì)A549 細(xì)胞有明顯的抑制作用（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3.3 傷口愈合試驗(yàn)和Transwell 試驗(yàn)

為了驗(yàn)證本研究制備的脂質(zhì)體是否能在體外抑制A549 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，采用了傷口愈合試驗(yàn)和Transwell 試驗(yàn)。靶向材料修飾的脂質(zhì)體能顯著抑制A549 細(xì)胞的遷移，并且這種作用明顯大于無(wú)靶向材料修飾脂質(zhì)體（P< 0.05）。Transwell 試驗(yàn)也表明R8修飾的脂質(zhì)體能更好的抑制細(xì)胞的遷移（P< 0.05），這與傷口愈合試驗(yàn)結(jié)果一致，見(jiàn)圖3。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 的表達(dá)

MMP-2、MMP-9、VEGF和bFGF蛋白通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)。DNR/HNK 脂質(zhì)體和R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體處理組的MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 蛋白表達(dá)均明顯降低（P< 0.05），其中R8-DNR/HNK脂質(zhì)體的降低幅度最大，見(jiàn)圖4。

3.5 體外攝取

各組細(xì)胞對(duì)藥物的吸收量為：游離的DNR ＞R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體＞DNR 脂質(zhì)體＞R8-空白脂質(zhì)體對(duì)照組。結(jié)果表明：R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體在A549細(xì)胞中吸收最好。由于DNR 的糖苷配基是熒光發(fā)光基團(tuán)，因此選擇制備上述三種脂質(zhì)體。結(jié)果表明以R8為靶向材料可以增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，見(jiàn)圖5。

3.6 體內(nèi)藥物攝取

給予荷瘤裸鼠各組別脂質(zhì)體后進(jìn)行活體圖像，來(lái)評(píng)估藥物在荷瘤小鼠的體內(nèi)分布，同時(shí)比較不同組間的熒光強(qiáng)度差別。對(duì)于DiR 游離藥在1 h 時(shí)即能檢測(cè)到強(qiáng)熒光，但隨著時(shí)間推移熒光強(qiáng)度降低較大，而靶向材料修飾的脂質(zhì)體組在24 h 時(shí)仍能檢測(cè)到熒光信號(hào)，同時(shí)靶向材料修飾的脂質(zhì)體組在給藥初期能更好的在體內(nèi)分布。上述結(jié)果表明R8修飾的脂質(zhì)體在荷瘤小鼠體內(nèi)循環(huán)時(shí)間最長(zhǎng)，并在腫瘤部位明顯積累，這可能是DSPE-PEG2000 的加入和R8的修飾增加了脂質(zhì)體的水溶性和靶向性，從而增加了脂質(zhì)體的主動(dòng)靶向性，見(jiàn)圖6。

4 討論

本研究構(gòu)建了R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，并對(duì)脂質(zhì)體的包封率、粒徑、Zeta 電位等理化性質(zhì)進(jìn)行表征。結(jié)果表明，脂質(zhì)體的各項(xiàng)理化指標(biāo)都在合理范圍內(nèi)，脂質(zhì)體形態(tài)呈均勻的圓形，粒徑均在100 nm 左右，這個(gè)粒徑大小有助于脂質(zhì)體通過(guò)EPR 效應(yīng)在腫瘤部位聚集。同時(shí)對(duì)脂質(zhì)體的抗腫瘤作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，分別考察了所制備的5 種脂質(zhì)體對(duì)A549 的細(xì)胞毒性，R8-空白脂質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞毒性，這也說(shuō)明載藥脂質(zhì)體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性由藥物自身引起的。通過(guò)考察脂質(zhì)體作用后轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 表達(dá)的變化，探索了制備的脂質(zhì)體抑制遷移的潛在機(jī)制。MMP-2、MMP-9 具有破壞基底膜，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移的作用，因此，抑制這兩種蛋白的表達(dá)對(duì)于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要意義。最后考察了脂質(zhì)體在體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)效應(yīng)，制備的脂質(zhì)體能延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的蓄留時(shí)間，在腫瘤部位的藥物濃度也得到了明顯提升。

R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體具有良好的抗腫瘤效果主要可能依賴(lài)以下三個(gè)方面：1. 構(gòu)建的脂質(zhì)體具有理想的理化性質(zhì)；2. R8作為靶向材料對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾，大大增加了藥物在腫瘤部位的蓄積和腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝??；3. HNK 作為調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)化療藥物的作用，主要通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF）來(lái)增強(qiáng)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用。

5 結(jié)論

根據(jù)最優(yōu)處方制備的脂質(zhì)體能夠通過(guò)多方面因素在體外明顯抑制A549 細(xì)胞的生長(zhǎng)以及侵襲，同時(shí)能明顯提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取能力，增加藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。本研究初步確定了制備的脂質(zhì)體的抗腫瘤活性，為后續(xù)藥物劑型開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

收稿日期：2021-12-09