朱文俊 楊萬(wàn)里 韋聰聰 劉 樂(lè) 耿照玉,2 陳興勇,2*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036)

番鴨為優(yōu)良瘦肉型鴨，具有生長(zhǎng)快、體重大、耐粗飼和肉質(zhì)好等特點(diǎn)，但其繁殖性能差，產(chǎn)蛋率低，且產(chǎn)蛋量在個(gè)體間存在顯著差異[1]。肝臟為機(jī)體物質(zhì)代謝主要器官，在脂質(zhì)合成、降解和運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用[2]。不同于哺乳動(dòng)物，禽類脂質(zhì)約90%于肝臟中合成。激素刺激肝臟合成低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)等脂類物質(zhì)，通過(guò)血液運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)到機(jī)體各部位。肝臟合成的脂類經(jīng)受體介導(dǎo)沉積于卵泡中，促進(jìn)等級(jí)前和等級(jí)卵泡發(fā)育[3]。此外，甘油磷脂、膽固醇、甘油三酯、載脂蛋白B等在產(chǎn)蛋期肝臟中大量合成[4-5]，可能與卵黃前體物形成和卵泡發(fā)育密切相關(guān)。推測(cè)，產(chǎn)蛋前后肝臟物質(zhì)合成差異可能在卵黃前體物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

已有研究表明家禽產(chǎn)蛋前后肝臟組織基因差異表達(dá)。Li等[2]比較雞產(chǎn)蛋前后(20和30周齡)肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)譜及相關(guān)通路差異，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在氧化還原、甾醇和膽固醇代謝過(guò)程、脂質(zhì)生物合成過(guò)程中顯著富集，表明產(chǎn)蛋時(shí)期肝臟轉(zhuǎn)錄組水平大部分變化與脂肪代謝密切相關(guān)；Bourin等[6]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法定義肝臟中與卵黃生成有關(guān)蛋白酶和抗蛋白酶基因，發(fā)現(xiàn)3個(gè)蛋白酶和反蛋白酶可能參與蛋黃形成。Li等[7]使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較IncRNA在產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期蛋雞肝臟表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)一系列與雞肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)的IncRNA；IncLTR受通過(guò)ERβ信號(hào)傳導(dǎo)的雌激素調(diào)控，與雞屠宰性狀和血液甘油三酯含量有關(guān)。盡管前人在家禽產(chǎn)蛋前后對(duì)肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組相關(guān)分析，解釋產(chǎn)蛋前后基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異，但受基因表達(dá)和翻譯水平調(diào)控影響，產(chǎn)蛋前后肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究不能完全解釋其參與肝臟代謝物合成的產(chǎn)物類型。

非靶向代謝組學(xué)(Nontargeted metabolomics, NTM)通過(guò)檢測(cè)一定質(zhì)量范圍內(nèi)所有離子，包括結(jié)構(gòu)獨(dú)特代謝物離子，為生物機(jī)體提供一個(gè)無(wú)偏倚的整體代謝物譜[8-9]。靶向代謝組學(xué)只對(duì)有限的幾個(gè)或幾類與生物學(xué)事件相關(guān)的代謝物進(jìn)行分析和研究，因此無(wú)法檢測(cè)未知代謝物。NTM可有效捕捉機(jī)體生命活動(dòng)過(guò)程中的細(xì)微變化，目前已成為畜禽育種、食品安全等領(lǐng)域研究的重要工具，包括畜禽經(jīng)濟(jì)性狀育種價(jià)值評(píng)估、畜禽產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)模型使用等。Wen等[10]使用UHPLC-MS非靶向代謝組學(xué)測(cè)定冷藏雞肉質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大多數(shù)氨基酸豐度降低，而組胺、酪胺、色氨酸和N-乙酰半胱氨酸等豐度增加。Yuan等[11]通過(guò)UHPLC-MS非靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)雞十二指腸中幾種糖類如纖維二糖，甘露糖和阿洛糖可能與蒼白桿菌和紅球菌共同降解木質(zhì)纖維素有關(guān)。本研究采用UPLC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，分析產(chǎn)蛋期與產(chǎn)蛋前期肝臟代謝物譜差異，為肝臟代謝物在卵泡發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制提供新的研究視角。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

產(chǎn)蛋前期(22周，2 152±73 g，TT 對(duì)照組)和產(chǎn)蛋期(40周，2 760±94 g，F(xiàn)T試驗(yàn)組)的健康番鴨各12羽地面平養(yǎng)于安徽安慶永強(qiáng)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)股份有限公司種鴨場(chǎng)。22周種鴨光照11 h/d，采食量103 g/d；40周齡種鴨光照17 h/d，采食量160 g/d，各飼養(yǎng)階段的營(yíng)養(yǎng)水平均按國(guó)家研究委員會(huì)(NRC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[12]。屠宰后，快速收集肝右葉樣本于液氮中保存，后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品前處理

肝臟組織樣本前處理方法按照He等[13]方法制備，并做適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取30 mg肝臟組織樣本轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，加入內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL；Lyso PC 17∶0，0.01 mg/mL)各20 μL，加入甲醇-水溶液(V∶V=4∶1)400 μL。-20 ℃預(yù)冷樣品2 min后，于全自動(dòng)樣品快速研磨儀中60 Hz研磨2 min。冰水浴中超聲10 min后于-20 ℃環(huán)境下靜置20 min。13 000 rpm、4 ℃離心10 min，取300 μL上清液真空干燥。加入400 μL甲醇-水溶液(V∶V=1∶4)，渦旋30 s后超聲 2 min 以充分復(fù)溶樣品。13 000 rpm、4 ℃離心樣品10 min，吸取上清液150 μL。使用0.22 μm有機(jī)相針孔過(guò)濾器過(guò)濾上清液并轉(zhuǎn)移至LC進(jìn)樣小瓶，-80 ℃ 保存，直至LC-MS上機(jī)分析。質(zhì)控樣本(QC)由所有樣本提取液等體積混合制備而成，每個(gè)QC體積與樣本相同。所有提取試劑使用前均在 -20 ℃ 預(yù)冷。

1.3 代謝物檢測(cè)

代謝物檢測(cè)方法按照He等[13]方法進(jìn)行，并做適當(dāng)修改。ACQUITY UPLC超高效液相系統(tǒng)(Waters公司， USA)串聯(lián)QE高分辨質(zhì)譜儀系統(tǒng)(Thermo Fisher公司, USA)用于分析ESI正負(fù)離子模式下的代謝譜。所使用色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)。二元梯度洗脫體系由流動(dòng)相A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸組成。梯度洗脫程序如下：0 min, 5% B；1 min, 5% B；12 min, 95% B；14 min, 95% B；14.1 min, 5% B；15 min, 5% B。流速：0.35 mL/min，柱溫：40 ℃。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：10 μL。

樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。質(zhì)譜參數(shù)如下：噴霧電壓：3 800V(+)/3 800V(-)；毛細(xì)管柱溫度：320 ℃(+)/320 ℃(-)；探針加熱溫度：350 ℃(+)/350 ℃(-)；鞘氣壓：45 Arb(+)/5 Arb(-)；輔氣壓：10 Arb(+)/10 Arb(-)；S-lens RF level：50(+)/50(-)；質(zhì)量范圍：100-1 200 m/z(+)/100-1 200 m/z(-)；一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000(+)/70 000(-)；二級(jí)質(zhì)譜分辨率：17 500(+)/17 500(-)；NCE/stepped NCE：10，20，40eV(+)/10，20，40eV(-)。質(zhì)譜分析過(guò)程中，每6個(gè)正式樣本中插入一個(gè)QC樣本，以用于評(píng)價(jià)整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中系統(tǒng)質(zhì)譜平臺(tái)穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

UPLC-MS獲得原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI軟件(V2.3，UK)作基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化?；衔镨b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片以及同位素分布，使用 The Human Metabolome Database(HMDB)、Lipidmaps(V2.3)以及METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性。使用包含保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰值強(qiáng)度和樣本信息的數(shù)據(jù)矩陣作統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)樣本、每個(gè)代謝物對(duì)應(yīng)峰值強(qiáng)度由該樣本總峰值強(qiáng)度校正。將正、負(fù)離子數(shù)據(jù)合并導(dǎo)入R包中作多元統(tǒng)計(jì)分析。采用主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)對(duì)試驗(yàn)組間代謝物變化作可視化分析。OPLS-DA分析中，變量權(quán)重值(VIP)用于衡量各代謝物表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力。為防止模型過(guò)擬合，7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)方法用于考察模型質(zhì)量。篩選VIP>1，P<0.05的差異代謝物。使用KEGG pathway(https:∥www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肝臟樣品差異代謝物作通路富集分析。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)用于比較對(duì)照組和試驗(yàn)組的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟代謝物定性分析

所有肝臟組織樣本均在UPLC-MS平臺(tái)上分析，代謝物在正、負(fù)離子模式下得到較好分離(圖1)。經(jīng)The Human Metabolome Database、Lipidmaps(V2.3)以及METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)定性，共鑒定到4 519種代謝物，其中負(fù)離子模式鑒定到1 708種代謝物，正離子模式鑒定到2 811種代謝物。

老陸變化太大了?？瓷先ケ饶氵€要老（我老嗎？），頭發(fā)都掉光了，禿腦門兒。上學(xué)那會(huì)，也算是個(gè)帥哥，現(xiàn)在整個(gè)一老頭模樣，簡(jiǎn)直不敢認(rèn)了。你知道他是做什么的嗎，教育局當(dāng)處長(zhǎng)，你知道他開(kāi)的什么牌子的車，奧迪Q 5，我操，六七十萬(wàn)吧！

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

主成分分析(PCA)模型中QC樣本緊密聚集，表明試驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性較好(圖2(a))。R2X為決定PCA模型質(zhì)量的主要參數(shù)，F(xiàn)T/TT組的R2X(cum)=0.507>0.5，表明PCA模型可靠。此外，PCA圖也顯示FT組和TT組完全分離，2組間差異顯著(圖2(b))。建立OPLS-DA模型進(jìn)一步驗(yàn)證代謝譜在FT組與TT組之間的分離。OPLS-DA模型參數(shù)R2Y(cum)=0.983，Q2(cum)=0.963均>0.5，表明模型建立較好。OPLS-DA圖中，F(xiàn)T組和TT組(圖2(c))完全分離，進(jìn)一步表明不同產(chǎn)蛋時(shí)期肝臟代謝物存在顯著差異。7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，Q2=-0.597<0，表明OPLS-DA模型沒(méi)有過(guò)擬合(圖2(d))。上述結(jié)果表明，F(xiàn)T組和TT組的肝臟樣本在PCA模型和OPLS-DA模型中均差異顯著，所獲得的數(shù)據(jù)可用于差異代謝物的篩選。

2.3 差異代謝物豐度變化分析

與TT組相比，在FT組中共篩選出324種差異代謝物，其中168種代謝物豐度顯著下調(diào)(P<0.05)，156種代謝物豐度顯著上調(diào)(P<0.05)。為更清楚了解代謝物豐度變化，繪制了324種差異代謝物熱圖(圖3)。熱圖分為2個(gè)聚類，每種差異代謝物在FT和TT組之間豐度均存在顯著差異(P<0.05)。根據(jù)物質(zhì)信息進(jìn)一步分類可將差異代謝物歸為12種類型：苯環(huán)型化合物、脂類及類脂分子、核苷，核苷酸及類似物、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)含氧化合物、有機(jī)雜環(huán)化合物、糖類多酮類化合物、生物堿及其衍生物、含氮有機(jī)物、有機(jī)硫化合物、有機(jī)磷化合物和未分類代謝物。分類信息表明脂類及類脂分子和有機(jī)酸及其衍生物這2類代謝物數(shù)量占比均較高，在上調(diào)差異代謝物中分別占19.87%和21.79%，在下調(diào)差異代謝物中分別占41.07%和13.1%(圖4)。

圖1 正離子(a)和負(fù)離子(b)模式下肝臟代謝物基峰強(qiáng)度色譜圖Fig.1 Base peak intensity chromatographs of liver metabolites obtained in ES+mode (a) and ES—mode (b)

(a)所有樣本PCA模型得分圖；(b)FT組和TT組PCA模型得分圖；(c)FT組和TT組OPLS-DA模型得分圖；(d)FT組和TT組排列測(cè)試圖。(a) PCA score plot for the data from QC samples and all groups; (b) PCA score plot for the data in FT group and TT group; (c) OPLS-DA score plot in FT group and TT group; (d) Permutation test plot in FT group and TT group.圖2 多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Multivariate statistical analysis

變化程度由不同顏色標(biāo)記，紅色或藍(lán)色分別表示代謝物相對(duì)增加或減少的水平。每列代表1個(gè)單獨(dú)樣品，每行代表1個(gè)差異代謝物。TT組為開(kāi)產(chǎn)前22周齡番鴨，F(xiàn)T組為產(chǎn)蛋期40周齡番鴨。The degree of change is marked by different colors, and red or blue represents the relatively increased or decreased levels of the metabolites, respectively. Each column represents an individual sample, and each row represents a differential metabolite. TT group represents Muscovy duck in pre-laying stage (22 wk), and FT group represents Muscovy duck in laying stage (40 wk).圖3 番鴨產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期肝臟差異代謝物熱圖分析Fig.3 Heat map analysis of hepatic differential metabolites of Muscovy duck in pre-laying and laying stages

圖4 番鴨產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期肝臟差異代謝物分類Fig.4 Classification of hepatic differential metabolites of Muscovy duck in pre-laying and laying stages

2.4 差異代謝物通路富集

通路富集分析可獲得46種差異代謝物的17個(gè)通路存在顯著差異(P<0.05)。通路富集表明，氨基酸代謝通路最為豐富，分別為甘氨酸，絲氨酸與蘇氨酸代謝、氨基酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、賴氨酸降解、精氨酸生物合成、精氨酸與脯氨酸代謝和半胱氨酸與蛋氨酸代謝。其中甘氨酸，絲氨酸與蘇氨酸代謝和氨基酸生物合成富集到的差異代謝物數(shù)量最多(圖5)。除葉酸一碳庫(kù)、半胱氨酸與蛋氨酸代謝、嘌呤代謝、賴氨酸降解和谷胱甘肽代謝通路下調(diào)外，其他12個(gè)通路均表現(xiàn)為顯著上調(diào)(表1)。

圖5 番鴨產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期差異代謝物KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of differential metabolites of Muscovy duck in pre-laying and laying stages

分析差異代謝物富集通路，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽、半胱氨酸和膽堿等在產(chǎn)蛋前后肝臟組織中代謝差異顯著。谷胱甘肽和半胱氨酸在FT組豐度顯著下調(diào)，膽堿在FT組豐度顯著上調(diào)，其log2FC分別為-1.48、-1.86和0.64(圖6)。谷胱甘肽參與鐵死亡、半胱氨酸和蛋氨酸代謝和谷胱甘肽代謝；半胱氨酸參與甘氨酸，絲氨酸與蘇氨酸代謝、氨基酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成、泛酸與CoA生物合成、鐵死亡、半胱氨酸與蛋氨酸代謝和谷胱甘肽代謝；膽堿參與甘氨酸，絲氨酸與蘇氨酸代謝和甘油磷脂代謝(表1)。

表1 番鴨產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期KEGG通路富集分析Table 1 Enrichment analysis of KEGG pathways of Muscovy duck in pre-laying and laying stages

柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)Columns marked with different letters represent significant difference (P<0.05) within groups.圖6 番鴨產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期關(guān)鍵差異代謝物豐度比Fig.6 Abundance ratio of key differential metabolites of Muscovy duck in pre-laying and laying stages

3 討 論

3.1 番鴨產(chǎn)蛋前后肝臟差異代謝譜分析

甘油磷脂和甘油三酯在分泌早期與載脂蛋白結(jié)合，形成富含甘油三酯的脂質(zhì)蛋白顆粒，在VLDL成熟分泌前進(jìn)一步引入甘油磷脂[14]，組裝成VLDL，成為肝臟分泌的主要脂質(zhì)成分。產(chǎn)蛋期間，在雌激素作用下每克肝臟每小時(shí)可轉(zhuǎn)錄出1.3×1011mRNA分子，相當(dāng)于每個(gè)肝細(xì)胞每分鐘轉(zhuǎn)錄出11個(gè)VTG mRNA分子，并經(jīng)翻譯后生成大量VTG進(jìn)入血液[15]。VLDL和VTG為2種主要卵黃前體物，在卵黃形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，分別構(gòu)成60%和24%卵黃干物質(zhì)以及共同構(gòu)成95%以上的卵黃脂質(zhì)[16-17]。本研究中，脂類及類脂分子和有機(jī)酸及其衍生物數(shù)量在FT/TT組占比均較高，可能與VLDL和VTG等卵黃前體合成有關(guān)。產(chǎn)蛋為一種復(fù)雜的生理過(guò)程，從差異代謝物類型可知產(chǎn)蛋涉及到糖代謝、核苷酸代謝、脂代謝、維生素代謝和氨基酸代謝等。

3.2 番鴨產(chǎn)蛋前后肝臟差異代謝通路分析

3.2.1氨基酸代謝通路

3.2.2甘油磷脂代謝

甘油磷脂為機(jī)體含量最多的一類磷脂，除構(gòu)成生物膜外，還是膽汁和膜表面活性物質(zhì)等成分之一，并參與細(xì)胞膜對(duì)蛋白質(zhì)識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)[19]。甘油磷脂合成于細(xì)胞質(zhì)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)高爾基體加工，在VLDL形成初期以及形成前參與其組裝[14,20]。在本研究中，甘油磷脂代謝通路(apla00564)上調(diào)，富集到的5種甘油磷脂，除磷脂酰絲氨酸外，膽堿、膽堿磷酸、甘油磷?；掖及泛蚅ysoPC(18∶1(9Z))在FT組豐度顯著增加，可能與肝臟代謝生成大量甘油磷脂以滿足VLDL組裝有關(guān)。

3.2.3核苷酸代謝

核苷酸是DNA和RNA的基本組成單位，是體內(nèi)合成核酸的前體物質(zhì)。在產(chǎn)蛋期肝臟核苷酸合成增加，GMPS和CMPK1基因顯著上調(diào)促進(jìn)嘧啶合成[21]，故嘧啶代謝(apla00240)代謝通路顯著上調(diào)。在本研究中，嘌呤代謝(apla00230)通路顯著下調(diào)，可能與增加ATP和rRNA合成速率有關(guān)[22]。

3.2.4維生素代謝

葉酸為嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸合成以及同型半胱氨酸合成蛋氨酸提供一碳單位[23-24]。葉酸不能由動(dòng)物組織合成，由外源性食物供給并由腸道吸收[25]。本試驗(yàn)番鴨屠宰前未進(jìn)食，且肝臟代謝需大量四氫葉酸提供一碳單位，導(dǎo)致葉酸一碳庫(kù)代謝通路(apla00670)富集到的2個(gè)差異代謝物5,10-亞甲基-四氫葉酸和5-甲基-四氫葉酸在FT組豐度顯著下調(diào)。

泛酸(維生素B5)為輔酶A(CoA)前體物，在調(diào)節(jié)碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸代謝等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。Youssef等[27]發(fā)現(xiàn)飼喂缺乏泛酸飼料的大鼠肝臟中，過(guò)氧化物酶體中脂肪酸β-氧化顯著降低。在本研究中泛酸和CoA生物合成通路(apla00770)上調(diào)，可能與維持產(chǎn)蛋期間肝臟正常代謝有關(guān)。

3.2.5其他代謝

谷胱甘肽代謝通路(apla00480)中，富集到的3種差異代謝物谷胱甘肽、抗壞血酸和半胱氨酸豐度均在FT組顯著下降。谷胱甘肽和抗壞血酸具有抗氧化性，可消除細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物和自由基[28]。40周齡為產(chǎn)蛋中期，番鴨可能適應(yīng)產(chǎn)蛋應(yīng)激，故谷胱甘肽和抗壞血酸豐度下降。

鐵死亡為依賴鐵離子及活性氧誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死，其在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及基因水平上均明顯不同于凋亡、壞死、自噬等其他形式細(xì)胞壞死[29]。研究表明鐵死亡生物學(xué)特征為鐵和活性氧聚集，激活絲裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)，降低胱氨酸攝取和增加谷胱甘肽消耗[30]。在本研究中，鐵死亡代謝通路(apla04216)上調(diào)，富集到的差異代謝物谷胱甘肽和半胱氨酸在產(chǎn)蛋期豐度顯著下降，而胱氨酸豐度顯著上調(diào)，符合鐵死亡生物學(xué)特征，可能與肝臟正常的調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死有關(guān)，但相關(guān)研究仍需繼續(xù)探究。

產(chǎn)蛋期氨基糖和核苷酸糖代謝通路(apla00520)顯著上調(diào)，富集到的6種差異代謝物除氨基葡萄糖外，N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-木糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸、6-磷酸-N-乙酰-D-氨基葡萄糖和N-乙酰甘露糖胺豐度在FT組顯著增加。有關(guān)核苷酸糖代謝通路中的代謝物在卵黃前體物合成中的作用機(jī)理尚無(wú)研究報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

3.3 番鴨產(chǎn)蛋前后肝臟關(guān)鍵差異代謝物分析

膽堿為蛋雞日糧必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是肝臟中磷脂酰乙醇胺(PE)合成磷脂酰膽堿(PC)反應(yīng)底物[31]。研究表明飼料中添加膽堿能提高母雞抗氧化能力、卵黃總脂和PC以及血清VLDL含量，增強(qiáng)肝臟GSH-Px活性和T-AOC，同時(shí)降低肝臟總脂、甘油三酯以及PC含量[32-33]。膽堿在產(chǎn)蛋期豐度顯著上升，可能與肝臟抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)，并增加PC含量。PC為VLDL主要成分，VLDL分泌和脂質(zhì)從肝臟向血液和周圍組織轉(zhuǎn)運(yùn)均需膽堿和PC。谷胱甘肽為細(xì)胞重要抗氧化劑，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)ATP依賴的谷氨酸-半胱氨酸連接酶和谷胱甘肽合成酶兩步合成，其合成速率受半胱氨酸限制。半胱氨酸參與多個(gè)氨基酸代謝通路、鐵死亡、谷胱甘肽代謝和泛酸與CoA生物合成等。有關(guān)半胱氨酸在禽類產(chǎn)蛋期作用機(jī)理研究報(bào)道較少，其在產(chǎn)蛋期豐度顯著下調(diào)，可能與產(chǎn)蛋應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)。