薛 源，趙宇蕾，齊謝敏，朱婷婷，黃曉暉，芮建中，周國華

0 引 言

咪唑立賓(Mizoribine，MZR)是由日本學(xué)者旭化成從土壤中分離的子囊菌M-2166株培養(yǎng)濾液中分離出來的一種咪唑類核苷，通過競爭性地抑制嘌呤合成系統(tǒng)中的次黃嘌呤核苷酸至鳥苷酸途徑從而抑制核酸合成，最終發(fā)揮免疫抑制作用[1]。腎病綜合征是一種兒童常見且具有挑戰(zhàn)性的慢性腎病，其中頻復(fù)發(fā)型腎病患兒占比約46%～51%[2]，MZR聯(lián)合足量激素治療頻復(fù)發(fā)型腎病患兒可減少復(fù)發(fā)和降低糖皮質(zhì)激素用量，提高臨床緩解率[3]。MZR口服易吸收，主要以原形從腎排泄，主要不良反應(yīng)為高尿酸血癥，與霉酚酸和硫唑嘌呤相比骨髓抑制作用較輕,也可導(dǎo)致血小板或紅細(xì)胞數(shù)量降低[4]。通過前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MZR的血清藥物濃度存在較大的個體差異，Ishida等[5]的研究表明，口服生物利用度(F)的個體差異是MZR藥代動力學(xué)變異的主要原因之一。

已有研究證明，MZR的有效性與血清藥物濃度存在相關(guān)性[6]。Xia等[7]的研究認(rèn)為MZR的藥效與血清藥物濃度及藥時曲線下面積(AUC)均存在較高相關(guān)性。AUC能夠體現(xiàn)體內(nèi)藥物的暴露水平，是研究藥代動力學(xué)及藥效學(xué)的重要指標(biāo)。使用傳統(tǒng)方法計(jì)算AUC存在其局限性，由于需要多點(diǎn)采集血樣，患者依從性差，研究成本過高，不適合在臨床使用。本文使用腎病患兒口服MZR后體內(nèi)血清藥物濃度數(shù)據(jù)，以有限采樣法(limited sampling strategy, LSS)通過較少血清藥物濃度(1或2個)建立數(shù)學(xué)模型，對MZR的AUC0-t進(jìn)行估算，同時以內(nèi)部數(shù)據(jù)通過JackKnife法進(jìn)行模型驗(yàn)證，并使用S形最大效應(yīng)(Emax)模型考察MZR有效性與AUC0-t的相關(guān)性。通過有限的單點(diǎn)或兩點(diǎn)血清樣本采集，估算患兒個體AUC0-t，并預(yù)測MZR臨床有效性，為臨床個體化給藥提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(G1322A在線脫氣機(jī)，G1311A泵，G1314A紫外檢測器，Agilent ChemStation化學(xué)工作站)；電子分析天平(XS205DU，Mettler Toledo)；pH計(jì)(PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。MZR對照品(純度>99%，日本旭化成公司，批號：BDNA-1378)；磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉(市售，藥用級)；甲醇(色譜純)；其他試劑為分析純；試驗(yàn)用水為市售純凈水。

1.2 色譜條件色譜柱：Megres C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-40 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=3.5，2∶98，v/v)；檢測波長：280 nm；柱溫室溫(25 ℃)；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 血樣采集與處理收集18例腎病綜合征患兒(其中男14例，女4例)血液樣本(服用咪唑立賓片75～300 mg)，每例患者均包括服藥前(0 h)以及服藥后2、3、4、6、8、12 h的7份樣本，收集于采血管中。離心分離血清，取上層血清樣品200 μL于離心管中，加入6% 高氯酸100 μL，旋渦混合15 s，13 000 r/min(離心半徑為30 mm)離心10 min后，取上清液檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析① 數(shù)據(jù)分析程序：IBM SPSS Statistics(Version 20.0, IBM Corp, USA), SAS 9.1 for windows (SAS institute inc. Cary , NC27513, USA), Phoenix 64(Version 8.1,Pharsight Corp, USA)。② 缺失數(shù)據(jù)補(bǔ)充：本研究收集了18例次患兒(其中1例為重復(fù)采樣)共計(jì)，103個血清樣本。采用Phoenix WinNonlin 8.1進(jìn)行房室模型擬合，考察MZR在兒童患者體內(nèi)的藥代動力學(xué)模型。在一房室模型的藥代動力學(xué)中，以血清藥物濃度取對數(shù)對時間作圖，在時間較大的區(qū)段內(nèi)近似為一條直線。使用第9、11、12例樣本中3 h與6 h的血清藥物濃度建立數(shù)學(xué)方程，得到直線的斜率和截距，計(jì)算缺失的4 h數(shù)據(jù)點(diǎn)血清藥物濃度。采用Phoenix WinNonlin 8.1，計(jì)算運(yùn)行條件為64位機(jī)，使用一房室模型法擬合，補(bǔ)充剩余的缺失數(shù)據(jù)點(diǎn)。③經(jīng)典藥代動力學(xué)參數(shù)計(jì)算：采用Phoenix WinNonlin 8.1，使用非房室模型法(NCA)計(jì)算腎病患兒口服MZR后AUC0-t。④LSS模型的建立：對18例次血清藥物濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)用SPSS進(jìn)行多元線性回歸，采用逐步篩選策略(Stepwise forward)遴選所有采血點(diǎn)中任意單點(diǎn)或兩點(diǎn)與AUC0-t相關(guān)性較好的回歸方程，確定與AUC0-t具有顯著相關(guān)性的采樣時間點(diǎn)。回歸方程公式：

AUC0-t=Intercept+M1×Ct1+M2×Ct2+M3×Ct3+…Mi×Cti(i≤2)

上述公式中AUC0-t為0到t的藥時曲線下面積，Intercept為截距，Mi為回歸系數(shù)，Cti為ti時間點(diǎn)MZR的血清藥物濃度。MZR半衰期較短，所有病例中只有一例測出C0，其余患兒C0均低于定量檢測下限或未檢測，12 h采血點(diǎn)與服藥時間間隔過長，臨床意義較低，且部分病例C12點(diǎn)血清藥物濃度偏低，難以檢測，所以在進(jìn)行多元回歸時，剔除C0、C12。⑤模型的驗(yàn)證：在缺少外部數(shù)據(jù)的情況下，采用JackKnife法進(jìn)行內(nèi)部模型驗(yàn)證[8]。以預(yù)測誤差(prediction error, PE%)、絕對預(yù)測誤差(absolute prediction error, APE%)、平均預(yù)測誤差(mean prediction error, MPE%)、誤差均方的平方根(root mean square prediction error, RMSE%)表示模型的準(zhǔn)確度。MPE越接近于0, RMSE越小, PE %及APE %不超過±15%的樣本數(shù)越少,擬合模型的準(zhǔn)確度越高。計(jì)算公式：

APE%=|PE%|

⑥AUC0-t與藥效相關(guān)性分析：大量蛋白尿是腎病綜合征患者主要的臨床表現(xiàn)，也是腎病綜合征最基本的病理生理機(jī)制，患者進(jìn)入緩解期后，使用試紙連續(xù)3d測得尿蛋白為3+(相當(dāng)于300mg/dL)則視為腎病綜合征復(fù)發(fā)?？疾炷I病患兒服用MZR 12個月后復(fù)發(fā)改善率與AUC0-t的相關(guān)性。復(fù)發(fā)改善率計(jì)算公式如下：

M為患者開始服用MZR前12個月內(nèi)腎病綜合征復(fù)發(fā)的次數(shù)，N為患者開始服用MZR后12個月內(nèi)腎病綜合征復(fù)發(fā)的次數(shù)。

S形最大效應(yīng)(Emax)模型是最常用的藥效學(xué)模型，用于藥物效應(yīng)隨濃度呈S形曲線變化時的藥效學(xué)研究，本研究采用Phoenix WinNonlin 8.1(PD模型)考察AUC0-t與復(fù)發(fā)改善率是否符合S形Emax模型。

2 結(jié) 果

2.1 MZR血藥濃度測定18例患兒(其中1例為重復(fù)采樣)口服MZR后，體內(nèi)藥代動力學(xué)特征符合一階房室模型，而不同時間點(diǎn)的血清藥物濃度均差別較大。見圖1。

圖1 口服MZR后血藥濃度-時間曲線

2.2 經(jīng)典藥動學(xué)計(jì)算結(jié)果使用Phoenix WinNonlin 8.1進(jìn)行藥動學(xué)計(jì)算時發(fā)現(xiàn)，不考慮滯后時間(Tlag)，藥時曲線精確度更高，所以本文在進(jìn)行藥代動力學(xué)計(jì)算時忽略了Tlag的影響。18例患兒主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。

表 1 基于非房室模型算法的藥代動力學(xué)參數(shù)

2.3 LSS法建立多元線性回歸方程使用LSS法以給藥后第2、3、4、6、8小時的血清藥物濃度建立AUC0-t的回歸方程，結(jié)果如下：AUC0-t=4.72 C2，R2為0.41；AUC0-t=5.78 C3，R2為0.95；AUC0-t=7.23 C4，R2為0.96；AUC0-t=8.77 C6+3.12，R2為0.95；AUC0-t=14.40 C8+4.02，R2為0.91。以給藥后第3、4小時兩點(diǎn)的血清藥物濃度建立AUC0-t的回歸方程為AUC0-t=2.57 C3+4.18 C4，R2為0.98。由結(jié)果可知，給藥后第3、4、6、8小時的血清藥物濃度與AUC0-t的相關(guān)性均較好(R2>0.9)，給藥后第2小時的血清藥物濃度與AUC0-t的相關(guān)性較差，R2僅為0.41，而用于估算的血清藥物濃度點(diǎn)由單點(diǎn)提升到兩點(diǎn)后，其相關(guān)性得到進(jìn)一步提高。

2.4 JackKnife法驗(yàn)證結(jié)果對單點(diǎn)中相關(guān)性最好的C4點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果表明，MPE為0.02，RMSE為0.15，APE%>15%的共有4例，分別為第3、8、11、12例數(shù)據(jù)。而驗(yàn)證C3、C4兩點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MPE為0.03，RMSE為0.14，APE%>15%的為第8、11、12例數(shù)據(jù)。見表2、表3。

表 2 JackKnife法驗(yàn)證C4單點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

表 3 JackKnife法驗(yàn)證C3、C4兩點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

2.5AUC0-t與藥效相關(guān)性分析結(jié)果本研究建立復(fù)發(fā)改善率與AUC0-t的S形Emax模型，見圖2。由S形Emax模型得知，Emax為94.20%，EC50為5.70 μg/mL，復(fù)發(fā)改善率與AUC0-t具有較好的相關(guān)性(R2=0.89)。

以AUC0-t對患兒服藥12個月后的尿蛋白水平作圖，見圖3。隨著患兒口服MZR后AUC0-t的升高，12個月后的尿蛋白水平呈下降趨勢，提示AUC0-t的增加對患兒的臨床結(jié)局能夠起到有效的改善作用。

圖 2 復(fù)發(fā)改善率隨AUC0-t變化曲線

圖 3 口服MZR 12個月后尿蛋白隨AUC0-t變化水平

3 討 論

LSS法已經(jīng)被成功應(yīng)用于預(yù)測霉酚酸、麥考酚鈉、白消安等藥物的AUC0-t[9-11]，本文以腎病患兒為研究對象，在國內(nèi)首次通過LSS法探討單點(diǎn)或兩點(diǎn)的血清藥物濃度對服藥后AUC0-t的預(yù)測結(jié)果，及AUC0-t對MZR療效的影響，結(jié)果對臨床有一定的指導(dǎo)意義。

從口服MZR后AUC0-t曲線得知，不同時間點(diǎn)的血清藥物濃度均差別較大，提示MZR體內(nèi)藥代動力學(xué)過程存在較大的個體差異，因此通過治療藥物監(jiān)測調(diào)控MZR血藥濃度，能夠有效保證MZR治療安全性和有效性。通過對比Liu、Hisashi和Nagai的文獻(xiàn)[12-14]發(fā)現(xiàn)，兒童與成人體內(nèi)PK過程存在差異，想要獲得相同的藥物峰濃度，兒童患者需要服用更高劑量的MZR。Chen等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，服用MZR后AUC0-t和谷濃度(C0)及峰濃度(Cmax)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.894和0.916(均P<0.001)，提示單點(diǎn)可用于評價體內(nèi)MZR的暴露量。使用LSS法建立多元回歸方程估算口服MZR后的AUC0-t，通過以每一個單點(diǎn)建立回歸方程后發(fā)現(xiàn)，C3、C4、C6、C8與AUC0-t的相關(guān)性均較好(R2>0.9)，提示C3、C4、C6、C8均可用于估算AUC0-t。Ishida等[5]使用LSS法分析得出，2個時間點(diǎn)(3 h和6 h)的血清藥物濃度對AUC0-t的估算最為準(zhǔn)確。而本研究估算2點(diǎn)與MZR的AUC0-t相關(guān)性時，得到相關(guān)性最好的兩點(diǎn)為3 h和4 h時的血清藥物濃度，從臨床實(shí)際考慮，采集3 h和4 h時的血樣具有更好的依從性。而4 h時的血清藥物濃度點(diǎn)在以單點(diǎn)及兩點(diǎn)建立回歸方程時均被選擇，可能是由于原始數(shù)據(jù)集中4 h采樣點(diǎn)有較多缺失，實(shí)際運(yùn)算時采用了一房室模型擬合的理想化數(shù)據(jù)導(dǎo)致。

使用JackKnife法驗(yàn)證單點(diǎn)與兩點(diǎn)預(yù)測AUC0-t的結(jié)果表明，C4點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，第3、8、11、12例數(shù)據(jù)APE%>15%(分別為20.02%、46.72%、26.94%、17.33%)，C3、C4兩點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，第8、11、12例數(shù)據(jù)APE%>15%(分別為33.77%、27.47%、22.94%)，預(yù)測誤差較大的數(shù)據(jù)減少且偏離程度相對降低，提示使用兩點(diǎn)預(yù)測模型后，血清藥物濃度點(diǎn)對AUC0-t預(yù)測的準(zhǔn)確性得到進(jìn)一步提高。由于臨床實(shí)際中，患兒采血依從性較差，第11、12例患兒只采集到3個血清藥物濃度點(diǎn)。而第8例患兒數(shù)據(jù)不符合一房室模型特征。為保證數(shù)據(jù)真實(shí)性與完整性，此3例數(shù)據(jù)被納入研究，使用NCA法計(jì)算時，可能使得AUC0-t觀測值與真實(shí)值產(chǎn)生較大偏差，最終導(dǎo)致模型驗(yàn)證時，APE%>15%。若剔除采樣點(diǎn)過少或不符合一房室的3例，則單點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，僅有1例數(shù)據(jù)APE%大于15%，而當(dāng)采用兩點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，APE%均小于15%。

S型Emax模型顯示AUC0-t的增加能夠減少患兒腎病綜合征復(fù)發(fā)的次數(shù)，通過對患兒12個月后的尿蛋白水平研究發(fā)現(xiàn)，隨著AUC0-t的增加，尿蛋白水平趨向于降低(圖3)，結(jié)果與S型Emax模型一致。而有研究證明，Cmax與復(fù)發(fā)改善率及尿蛋白的降低亦有較高的效應(yīng)相關(guān)，該研究建立Cmax與復(fù)發(fā)改善率的S型Emax模型得知，Emax為93.30%，EC50為1.2 μg/mL，R2為0.87，提示AUC0-t與Cmax均可以評價MZR的有效性[8]。朱婷婷等[16]的研究認(rèn)為在臨床實(shí)踐中監(jiān)測C2或C3時間點(diǎn)濃度具有臨床應(yīng)用價值。然而臨床實(shí)際中達(dá)到Cmax的時間因人而異，對比不同的研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，Tmax分布于2 h至6 h，本研究通過NCA法得到的Tmax為(2.39±0.50)h。所以從臨床實(shí)際綜合考慮，相對于獲得不同患者的Cmax，采集患者固定單點(diǎn)或兩點(diǎn)的血藥濃度，通過LSS法估算AUC0-t，可能更易于評價MZR有效性。

本研究使用LSS法估算口服MZR后的AUC0-t，結(jié)果提示單點(diǎn)和兩點(diǎn)對AUC0-t的預(yù)測結(jié)果良好，兩點(diǎn)法預(yù)測AUC0-t更優(yōu)。從臨床實(shí)際出發(fā)，單點(diǎn)推薦C3，兩點(diǎn)推薦C3和C4。采用單點(diǎn)或兩點(diǎn)估算AUC0-t能夠減少采血點(diǎn)，提高患者依從性，同時減少檢測成本，為臨床提供便利。