熊亞莉，徐慶慶，唐 健

0 引 言

自2019年12月以來(lái)，國(guó)內(nèi)外相繼發(fā)生新型冠狀病毒導(dǎo)致的肺炎，目前已經(jīng)是全球大流行，WHO命名為“2019冠狀病毒病”(COVID-19)。該病原體是一種新的冠狀病毒，被命名為2019嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，簡(jiǎn)稱新型冠狀病毒。國(guó)家衛(wèi)健委診療規(guī)范第七版[1]之前是將核酸檢測(cè)作為確診新型冠狀病毒肺炎的金標(biāo)準(zhǔn)，但核酸檢測(cè)存在假陰性，而特異性抗體檢測(cè)可以作為核酸檢測(cè)的重要補(bǔ)充[2]，目前已被納入確診標(biāo)準(zhǔn)之一[1]。新型冠狀病毒特異性IgM抗體多于發(fā)病3～5 d后開始產(chǎn)生[1]，IgG抗體可在10～15 d產(chǎn)生[3]。但病程中新型冠狀病毒特異性抗體的變化情況尚不清楚。本研究擬探討新型冠狀病毒特異性IgM、IgG抗體的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，并進(jìn)一步明確特異性抗體檢測(cè)在新型冠狀病毒肺炎診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2020年2月至3月南京鼓樓醫(yī)院援鄂醫(yī)療隊(duì)在華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院光谷院區(qū)收治的59例新型冠狀病毒肺炎的患者。確診標(biāo)準(zhǔn)參見國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》第七版[1]，患者均有臨床流行病學(xué)史，符合3條臨床表現(xiàn)的2條及以上[發(fā)熱和(或)呼吸道癥狀、影像學(xué)顯示雙肺有磨玻璃影或斑片影、發(fā)病早期血常規(guī)白細(xì)胞正?；驕p低、淋巴細(xì)胞減少或減低]，及病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)之一(實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性，或血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽(yáng)性，或血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高)。

1.2 檢測(cè)方案入院時(shí)每例患者行特異性IgM、IgG抗體檢測(cè)以及咽拭子新型冠狀病毒核酸檢測(cè)。IgM抗體或核酸檢測(cè)陽(yáng)性者，1周后復(fù)查，直至IgM抗體轉(zhuǎn)陰或核酸兩次以上陰性出院時(shí)為止。另予檢測(cè)血常規(guī)、生化全套(肝功能、血脂、空腹血糖、腎功能、尿酸、乳酸脫氫酶等)、淀粉酶、肌酸激酶、肌鈣蛋白I、凝血五項(xiàng)(凝血酶原時(shí)間、活化凝血酶原時(shí)間、纖維蛋白原、凝血酶時(shí)間、D-二聚體)、淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子譜、胸部CT等，根據(jù)結(jié)果定期復(fù)查。

1.3 試劑新型冠狀病毒特異性IgM及IgG抗體定量檢測(cè)：空腹采血，采用深圳亞輝龍生物科技有限公司的新型冠狀病毒2019-nCoV抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光法，批號(hào)：20200206)，正常值參考范圍為≤10U/mL。新型冠狀病毒ORF1ab/N基因雙重核酸檢測(cè)：采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增分析(熒光定量RT-PCR法)。

2 結(jié) 果

2.1患者臨床特征及入院時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢查59例患者入院時(shí)平均病程(3.81±2.2)周。合并癥中最常見的是高血壓病，其次是腦梗死、糖尿病及冠心病。60%以上患者起病有發(fā)熱或咳嗽癥狀。見表1。血常規(guī)中淋巴細(xì)胞減少最常見。淋巴細(xì)胞亞群分析顯示約25%患者CD4、CD8、NK細(xì)胞數(shù)量降低，而B細(xì)胞數(shù)量降低相對(duì)少見。5%～39%患者并發(fā)肝、腎、胰腺、心肌、凝血等器官系統(tǒng)功能損害。見表2。

2.2新型冠狀病毒特異性抗體及核酸檢測(cè)的敏感性分析59例患者住院期間抗體和核酸檢測(cè)分別為107人次、148人次。9例(15.3%)患者入院前后連續(xù)3次以上新冠病毒核酸檢測(cè)均呈陰性，但入院后特異性IgG抗體均呈陽(yáng)性，其中7例(11.9%)患者IgM抗體同時(shí)呈陽(yáng)性；且另有2例患者核酸檢測(cè)陽(yáng)性，IgM、IgG抗體卻均呈陰性。核酸檢測(cè)敏感性為84.74%(50/59)，IgG抗體檢測(cè)敏感性為96.61%( 57/59)，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)。見表3。

表 1 本組新型冠狀病毒肺炎患者的臨床特征

表 2 新型冠狀病毒肺炎患者入院時(shí)的異常實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

表 3 新型冠狀病毒特異性IgM、IgG抗體與核酸檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果比較(n)

2.3新型冠狀病毒特異性抗體及核酸動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 新型冠狀病毒特異性抗體及核酸檢測(cè)標(biāo)本每周陽(yáng)性率148人次新型冠狀病毒核酸檢測(cè)中，最早病程第2周即有檢測(cè)呈陰性者，最晚第8周時(shí)仍有1例次呈陽(yáng)性。107人次新冠病毒特異性抗體檢測(cè)中，2例患者共3人次IgM、IgG檢測(cè)均呈陰性，分別處于病程第4、6和7周。IgM 抗體檢測(cè)最早病程第3周即有1人次呈陰性，最晚第9周時(shí)仍有1人次呈陽(yáng)性。IgG抗體檢測(cè)在病程第2-9周中除2例患者3人次外呈陰性外，其余均呈陽(yáng)性。見圖1。

圖 1 新型冠狀病毒特異性抗體及核酸每周檢測(cè)陽(yáng)性率

2.3.2 新型冠狀病毒特異性抗體滴度變化59例患者病程第2-4周新型冠狀病毒特異性IgM 抗體滴度為32.09(6.87，74.95)U/mL，第5-6周為29.72(11.39，56.62)U/mL，第7-9周為13.8(6.89，27.76)U/mL，僅第5-6周與第7-9周IgM 抗體滴度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。第2-4周新型冠狀病毒特異性IgG抗體滴度為102.66(61.33，202.56)U/mL，第5-6周為158.80(95.40，208.76)U/mL，第7-9周為88.35(75.70，104.29)U/mL，僅第5-6周與第7-9周IgG 抗體滴度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。見圖2。

2.3.3 新型冠狀病毒特異性抗體及核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)陰時(shí)間在住院期間的連續(xù)檢測(cè)中，37例(62.7%)患者新型冠狀病毒核酸由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性，轉(zhuǎn)陰時(shí)間為病程(5.76±1.95)周；15例(25.4%)患者新型冠狀病毒特異性IgM抗體發(fā)生轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰時(shí)間為病程(6.73±1.48)周；無(wú)患者在9周病程內(nèi)發(fā)生新型冠狀病毒特異性IgG抗體轉(zhuǎn)陰。

2.4新型冠狀病毒特異性IgM抗體及核酸轉(zhuǎn)陰的影響因素單因素分析顯示CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)減低(P=0.047)、IL-2R水平增高(P=0.025)與IgM抗體轉(zhuǎn)陰相關(guān)。多因素分析顯示CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)減低(HR：3.541， 95%CI：1.014～12.364)、IL-2R水平增高(HR ：5.450，95%CI：1.048～28.340)是IgM抗體轉(zhuǎn)陰的影響因素(P<0.05)。見表4。

*P<0.05

表 4 新型冠狀病毒特異性IgM抗體轉(zhuǎn)陰的影響因素分析

3 討 論

特異性抗體的檢測(cè)是目前很多感染性疾病的常規(guī)診斷方法，如果患者體內(nèi)存在類風(fēng)濕因子、自身抗體等可以導(dǎo)致抗體檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性可能[4]，但目前研究顯示新型冠狀病毒特異性IgM、IgG抗體檢測(cè)的特異性相對(duì)較高，為90%～96%[5-7]。本研究中存在9例核酸檢測(cè)陰性、特異性抗體檢測(cè)陽(yáng)性的患者，這部分患者流行病學(xué)及臨床特征均符合新型冠狀病毒肺炎的疑似診斷標(biāo)準(zhǔn)，且特異性抗體滴度有動(dòng)態(tài)變化，故考慮抗體檢測(cè)為假陽(yáng)性可能極小。對(duì)于疑似患者，尤其是核酸反復(fù)檢測(cè)呈陰性者，特異性IgM、IgG抗體應(yīng)該作為常規(guī)檢測(cè)方法之一，這樣能減少因病毒載量極低或采樣所致的核酸檢測(cè)假陰性帶來(lái)的漏診。由于操作或標(biāo)本保存問題，抗體檢測(cè)也存在假陰性可能，文獻(xiàn)報(bào)道新型冠狀病毒特異性抗體檢測(cè)的敏感性為85%～92%[5-7]。臨床研究和專家共識(shí)顯示化學(xué)發(fā)光法靈敏度高于膠體金法，具有操作方便、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。本研究顯示2例患者多次核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性，結(jié)合流行病學(xué)及臨床特征均符合新型冠狀病毒肺炎的確診標(biāo)準(zhǔn)，而IgM、IgG抗體定量檢測(cè)均為陰性，檢測(cè)時(shí)間分別為病程的第4周及第6-7周，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道新型冠狀病毒特異性IgM抗體檢測(cè)的窗口期可能為8 d左右，這2例患者已過窗口期，故考慮檢測(cè)結(jié)果陰性非病程所致[5]。但即使如此，本研究顯示聯(lián)合IgM、IgG抗體檢測(cè)敏感性仍可達(dá)96.61%。可見，新冠病毒特異性IgM、IgG抗體定量檢測(cè)可以作為一項(xiàng)很好的診斷指標(biāo)，對(duì)于新型冠狀病毒感染疑似患者的確診以及無(wú)癥狀感染者的篩查具有重要意義[10]。由于存在“窗口期”，抗體檢測(cè)可能出現(xiàn)“假陰性”，由于交叉反應(yīng)、內(nèi)源性或外源性干擾物的影響，導(dǎo)致“假陽(yáng)性”結(jié)果，因此強(qiáng)調(diào)多次動(dòng)態(tài)檢測(cè)抗體以提高診斷的準(zhǔn)確性[11]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在病程15～30 d時(shí)新型冠狀病毒特異性IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性率最高，病程15 d后、出院后14 d與病程7 d以內(nèi)的IgM抗體水平相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[5]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，IgM抗體8 d后陽(yáng)性率達(dá)100%，28 d后IgM抗體開始消失[6]，但尚少有IgM抗體在病程4周以后滴度的變化以及轉(zhuǎn)陰情況的報(bào)道。本研究顯示病程第3周及第5周時(shí)IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性率最高，分別為83.33%和76%。第2-4周與第5-6周IgM抗體滴度沒有明顯差別，而第7-9周較第5-6周有明顯下降(P=0.02)，顯示第7周以后IgM抗體滴度下降明顯。本研究沒有發(fā)現(xiàn)IgM滴度的早期峰值，考慮與本研究中患者入院時(shí)病程普遍偏晚有關(guān)。但重要的是，本研究動(dòng)態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)15例患者住院期間發(fā)生了IgM抗體的轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰時(shí)間在病程的(6.73±1.48)周，故IgM抗體可能可用于起病或隱性感染7周以內(nèi)現(xiàn)癥感染的診斷。IgG抗體滴度在第5-6周高于第2-4周，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這同樣不排除本研究早中期患者樣本量偏少所致。第7-9周滴度較第5-6周明顯下降(P=0.01)，雖然在病程第7周以后IgG抗體滴度也有下降，但病程第9周時(shí)滴度仍然明顯高于正常值，且沒有患者在此期間轉(zhuǎn)陰。因此，本研究提示，IgG抗體至少可用于起病或隱性感染9周以上的恢復(fù)期或既往感染的診斷。而IgG抗體持續(xù)陽(yáng)性的更長(zhǎng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)有待于對(duì)患者長(zhǎng)期隨訪后確定。本研究初步探討了新型冠狀病毒肺炎病程不同時(shí)間段IgM、IgG抗體的變化特點(diǎn)，同其他很多感染性疾病一樣，新型冠狀病毒特異性IgM與IgG抗體滴度也呈升高、下降的動(dòng)態(tài)變化過程，通過動(dòng)態(tài)檢測(cè)、聯(lián)合檢測(cè)能有助于判斷患者病程階段。

既往在SARS中研究顯示，患者病情越重，病毒特異性抗體滴度越高，高峰期延遲[12]。新型冠狀病毒肺炎特異性抗體變化特點(diǎn)尚不完全清楚，其轉(zhuǎn)陰影響因素亦未見報(bào)道。目前認(rèn)為，新型冠狀病毒肺炎后期病情的惡化可能是病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子風(fēng)暴所致[13]。研究表明，患者CD4+T、CD8+T細(xì)胞活化增加、數(shù)量減少，同時(shí)B細(xì)胞減少，DC細(xì)胞和B細(xì)胞活化亦減少。CD4+T細(xì)胞功能的代償性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致了細(xì)胞因子風(fēng)暴[14]。免疫活化時(shí)，CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD25，可溶性CD25(也即是IL-2R)釋放進(jìn)入血流，因此IL-2R水平體現(xiàn)了CD4+T細(xì)胞的活化程度。隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平顯著增加，IL-2R的濃度與IL-6、TNF-α呈正相關(guān)，與淋巴細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān)，IL-2R與淋巴細(xì)胞數(shù)量的比值能預(yù)測(cè)患者預(yù)后[15]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-2R是IgM抗體轉(zhuǎn)陰的獨(dú)立影響因素，提示患者IL-2R水平越高，IgM抗體轉(zhuǎn)陰時(shí)間可能越長(zhǎng)。IL-2R升高與IgM抗體陰轉(zhuǎn)之間的相關(guān)性體現(xiàn)了機(jī)體細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng)之間的某種關(guān)聯(lián)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究中，B細(xì)胞數(shù)量與新型冠狀病毒IgM抗體轉(zhuǎn)陰之間沒有發(fā)現(xiàn)明確相關(guān)性。但由于本研究病例數(shù)較少，尚有待于擴(kuò)大樣本數(shù)量驗(yàn)證上述結(jié)論，同時(shí)也有必要進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究明確新型冠狀病毒對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的影響。

綜上所述，本研究明確了病毒特異性IgM、IgG抗體檢測(cè)對(duì)于新型冠狀病毒肺炎的診斷、尤其是核酸陰性患者的診斷具有重要價(jià)值，通過對(duì)病程中IgM、IgG抗體滴度的變化特點(diǎn)、IgM抗體轉(zhuǎn)陰時(shí)間的分析，提示特異性IgM、IgG抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化可能有助于病程判斷，而IgG抗體留存時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)于至少9周以上的感染者、尤其是無(wú)癥狀既往感染者具有診斷價(jià)值。但本研究也存在一些缺陷，如納入樣本數(shù)不多、檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)不完全統(tǒng)一、觀察到轉(zhuǎn)陰的病例數(shù)較少、缺乏長(zhǎng)期隨訪結(jié)果等，有待于今后進(jìn)一步完善和通過其他研究進(jìn)行驗(yàn)證。