王翔宇，田志龍，潘林香，王金文，狄 冉，劉秋月，胡文萍，馬 琳，儲明星*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2. 濟南市萊蕪嬴泰農(nóng)牧科技有限公司，山東 濟南 271114；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南 250100)

中國肉羊生產(chǎn)方式由放牧向舍飼轉(zhuǎn)型過程中，多羔綿羊品種使用日漸增加。在多羔綿羊新品種培育中，產(chǎn)羔數(shù)性狀尤為重要[1]。產(chǎn)羔數(shù)是低遺傳力性狀，通過控制多羔性狀的遺傳標(biāo)記進行標(biāo)記輔助選擇育種可以加快該性狀選擇的遺傳進展[2]。

哺乳動物的排卵是一個激素依賴的過程。排卵前，優(yōu)勢卵泡會受到促黃體素(luteinizing hormone, LH)峰的誘導(dǎo)排卵。排卵后，LH依然發(fā)揮重要作用，它通過維持黃體產(chǎn)生孕酮維持妊娠。如果LH作用的劑量和時間存在偏差將會導(dǎo)致不育。因此，其受體促黃體素受體(luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor, LHCGR)在維持LH發(fā)揮正常生理功能中發(fā)揮重要作用[3]。LHCGR是G蛋白的經(jīng)典受體，包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞外激素結(jié)構(gòu)域[4]。LHCGR主要發(fā)揮作用的部位是卵巢，卵巢壁細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、卵泡發(fā)育后期的顆粒細(xì)胞以及黃體細(xì)胞中都檢測到其表達[5]。綿羊LHCGR在綿羊的3號染色體上，有11個外顯子。綿羊卵泡在發(fā)育排卵過程中，需要通過顆粒細(xì)胞上LHCGR接受促黃體素(luteinizing hormone, LH)進行優(yōu)勢卵泡的選擇，它是優(yōu)勢卵泡產(chǎn)生的標(biāo)記基因[3]。LHCGR對哺乳動物繁殖效率有不同影響，LHCGR上的突變有些產(chǎn)生了有害的表型，但有些卻會產(chǎn)生令人意想不到的變化。研究表明，LHCGR敲除小鼠表現(xiàn)為不育[6]。人LHCGR突變會導(dǎo)致女性多囊卵巢綜合征的發(fā)病幾率增加[7]。LHCGR突變會降低奶牛超數(shù)排卵的效率[8]。綿羊中，F(xiàn)ecB突變可以增加LHCGR的表達，從而降低了優(yōu)勢卵泡的凋亡，增加綿羊排卵數(shù)[9]。而對于LHCGR突變對綿羊繁殖效率影響的報道卻不多見。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇和DNA提取

從山東省萊蕪市嬴泰有機農(nóng)業(yè)科技有限公司隨機收集具有產(chǎn)羔記錄的384只魯中肉羊頸靜脈血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按照天根血液DNA試劑盒(天根公司，北京)說明進行試驗綿羊血液樣本DNA提取，使用Nano Drop2000檢測DNA濃度，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA完整性進行檢測。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)SNP位點序列信息，使用Sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay design3.1,設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴展引物并合成。

表1 用于SequenomMassARRAYSNP分型引物Table 1 The primer information for genotyping

1.3 基因分型

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計綿羊LHCGR基因g.75741060A>C和g.75748150A>G位點的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)，隨后對該群體不同SNP位點進行Hardy-Weinberg檢測。

使用yijkl=μ+Si+Pj+Gk+eijkl模型進行魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)和2個SNP關(guān)聯(lián)分析。(yijkl：產(chǎn)羔數(shù)；μ：產(chǎn)羔數(shù)均值；Si：第i個季節(jié)效應(yīng)；Pj：第j個胎次效應(yīng)；Gk：LHCGR基因第k種基因型效應(yīng)；eijkl：隨機殘差效應(yīng))。用SAS 9.0軟件中GLM模型進行最小二乘分析，并對同一胎次中不同基因型差異進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LHCGR基因多態(tài)性分析

從表2可知，在魯中肉羊群體中，LHCGR基因g.75741060A>C和g.75748150A>G位點中AA均為優(yōu)勢基因型，A均為優(yōu)勢等位基因，這兩個位點在魯中肉羊群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25

2.2 LHCGR基因突變位點與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

由表3可知，LHCGR基因g.75741060A>C突變可以顯著增加魯中肉羊第4胎產(chǎn)羔數(shù)(P<0.05)。其中第4胎時，突變純合CC型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于野生型AA和雜合子AC。g.75748150A>G的G突變可以降低魯中肉羊的第4胎產(chǎn)羔數(shù)(P<0.05)，該位點突變純合型GG和雜合子AG的產(chǎn)羔數(shù)顯著低于野生純合型AA。

表2 魯中肉羊LHCGR基因不同SNP位點群體遺傳學(xué)分析Table 2 Population genetic analysis of g.75741060A>C and g.75748150A>G of LHCGR gene in Luzhong Mutton Sheep

表3 LHCGR基因不同位點各基因型與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析Table 3 Association analysis between different genotypes of two SNPs of LHCGR gene and litter size of Luzhong Mutton Sheep

3 討 論

LHCGR突變在不同物種中對繁殖性狀產(chǎn)生不同影響。在水牛[13]、大白和長白豬[14]以及濟寧青山羊[15]的外顯子中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些SNPs，但這些SNPs與繁殖性狀沒有關(guān)聯(lián)。在人類的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，促進LHCGR蛋白功能的突變可以引起家族性男性性早熟；而抑制LHCGR功能的突變會引起女性的生育能力低下或者不育[5]。LHCGR突變可以改變奶牛對超數(shù)排卵的敏感性[16]。近年來，在對多羔品種的綿羊研究中，利用Ovine SNP50芯片對單羔和多羔綿羊進行GWAS分析發(fā)現(xiàn)，伊朗Lori-Bakhtiari綿羊的LHCGR基因上2個SNP位點與該品種多羔性狀相關(guān)聯(lián)，LHCGR是控制該品種多羔性狀的主效基因[17]。在小尾寒羊中發(fā)現(xiàn)了2個突變位點，其中g(shù).75741060A>C突變可以增加產(chǎn)羔數(shù)；而g.75748150A>G則會降低產(chǎn)羔數(shù)，這與本試驗中這兩個位點對魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的影響一致[11]。LHCGR基因g.75741060A>C和g.75748150A>G在魯中肉羊群體中都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，有一定頻率的雜合子。該群體的這兩個位點沒有經(jīng)歷選擇。與本試驗室先前多羔小尾寒羊群體中這兩個突變的頻率[11]相比，魯中肉羊g.75741060A>C突變純合子CC的頻率低于小尾寒羊，g.75748150A>G中GG頻率高于小尾寒羊。因此，想要在多羔魯中肉羊的培育過程中提高產(chǎn)羔數(shù)，需要增加g.75741060A>C中CC頻率，減少g.75748150A>G中GG頻率。

LH在排卵前脈沖式增加會激活成熟卵泡卵泡膜和顆粒細(xì)胞上的LHCGR形成獨特的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，以觸發(fā)多條細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，從而介導(dǎo)一系列排卵相關(guān)基因的表達[18]。壁顆粒細(xì)胞和排卵前卵泡的卵泡膜細(xì)胞中LHCGR的mRNA和LHCGR蛋白表達水平比卵丘細(xì)胞高一個數(shù)量級，其中LHCGR表達被卵母細(xì)胞衍生的信號抑制[6]。因此，適當(dāng)LHCGR的表達水平對LH精準(zhǔn)發(fā)揮其在卵巢中調(diào)控排卵前類固醇激素生成、排卵、黃體形成和黃體細(xì)胞類激素生成等一系列功能至關(guān)重要[19]。LHCGR基因上既存在降低LHCGR表達量的突變，也存在增加LHCGR表達量的突變。在綿羊中，LHCGR基因主要通過增加表達量，提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)。通過對高繁殖力母羊的研究發(fā)現(xiàn)，具有高繁基因的母羊卵泡在較小直徑即可以響應(yīng)LH變化。在小卵泡(直徑1～3 mm)和中等卵泡(直徑3～4.5 mm)的顆粒細(xì)胞中，具有高繁突變綿羊LHCGR基因的mRNA表達量高于野生型[20]。有研究表明，在含有Booroola和Inverdale基因的多羔綿羊中，LHCGR表達量在優(yōu)勢卵泡選擇的關(guān)鍵時期顯著高于單羔綿羊[21]。在對單、多羔湖羊卵巢組織甲基化狀態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)羔數(shù)的湖羊LHCGR部分區(qū)域的去甲基化狀態(tài)顯著高于單羔湖羊，說明高產(chǎn)羔數(shù)的湖羊LHCGR表達量較高[22]。LHCGR特異地在多羔小尾寒羊卵巢中表達[23]。因此，在魯中肉羊中檢測到g.75741060A>C的突變可能是增加了LHCGR在卵巢中的表達量，從而提高了LHCGR對于LH敏感性進而增加魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)。

4 結(jié) 論

魯中肉羊群體中g(shù).75741060A>C突變可以增加產(chǎn)羔數(shù)，g.75748150A>G卻降低產(chǎn)羔數(shù)，因此，在今后的育種過程中需要通過人工選擇，增加g.75741060A>C位點C的頻率，降低g.75748150A>G位點G的頻率，從而輔助多羔魯中肉羊的培育。而對于g.75741060A>C突變是否通過增加LHCGR基因的表達量增加產(chǎn)羔數(shù)的分子機制還需要進一步驗證。