李孟珠 王高鵬 巫月 任怡 李剛華 劉正輝 丁艷鋒 陳琳

（南京農業(yè)大學 農學院, 南京 210095；*通信聯系人, E-mail: linchen@njau.edu.cn）

同化產物蔗糖運輸能力不足，造成空癟粒高，已成為限制水稻產量潛力發(fā)揮的主要因素。植物光合固定的碳水化合物一部分直接通過糖酵解等方式參與細胞代謝[1]，一部分以蔗糖或者淀粉的形式儲存在液泡與葉綠體中，大部分光合固定的碳水化合物直接通過韌皮部裝載，并以蔗糖的形式由葉肉細胞輸出，經過長距離運輸和韌皮部卸載轉運至“庫”器官，維持植物的生長發(fā)育過程[2,3]。生物信息學和細胞亞顯微結構分析表明，水稻葉片中薄壁細胞和伴胞的胞間連絲頻率僅為其他各類細胞間胞間連絲總頻率的1.4%[4]；水稻中存在可以驅動蔗糖/H+跨膜轉運的質膜ATPase 質子動力勢[5]；小葉脈中存在可以為質外體裝載提供動力所必需的蔗糖合酶、質膜定位的質子焦磷酸酶[6]等，表明水稻可能主要采用質外體進行裝載。韌皮部裝載效率直接影響蔗糖轉運及其在庫端的卸載能力。因此，鑒定參與裝載的主效蔗糖轉運蛋白對提高作物源庫效率具有重要意義。

光合同化產物蔗糖的運輸與分配主要由蔗糖轉運蛋白來調控。蔗糖轉運蛋白執(zhí)行蔗糖從“源”到“庫”的質外體運輸，在蔗糖的感應、“源”器官裝載、韌皮部長距離運輸和“庫”器官卸載等過程中都發(fā)揮著重要作用[7]。目前，已從水稻中鑒定出 5 個 SUT 家族成員，分別為 OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4 和 OsSUT5[8]。OsSUT1 是研究最為廣泛的SUT 家族成員，在發(fā)芽種子中具有最高的表達量。反義抑制OsSUT1的表達會導致種子發(fā)芽遲緩[9]，葉片中碳水化合物含量沒有顯著變化，植株灌漿受到抑制，水稻結實率下降[10]，表明OsSUT1 是籽粒灌漿過程中影響蔗糖卸載的關鍵因子。OsSUT1的GUS 染色和免疫定位結果顯示其存在于所有營養(yǎng)組織的成熟韌皮部中，且在籽粒灌漿期參與同化物蔗糖的長距離運輸過程。此外，OsSUT1 還能在蔗糖運輸途徑中從質體外回收蔗糖，保證籽粒灌漿過程中同化物的供應[11]。OsSUT2 定位在液泡膜上[12]，將蔗糖從液泡轉運至葉肉細胞，供給韌皮部裝載所需的蔗糖，維持植株正常生長。OsSUT2突變后導致葉片可溶性糖積累，向外輸出減少，庫端蔗糖供應不足，產量下降[13]。OsSUT3與OsSUT5表達模式類似，在葉片中表達量較高，在萌發(fā)的種子中表達量較低，對OsSUT3的定位研究發(fā)現其在花粉中大量表達，表明OsSUT3 可能在蔗糖進入花粉細胞過程中起重要作用[8]。目前對OsSUT4 的功能研究比較少。本研究應用CRISPR/Cas9 技術構建ossut4單缺失變體材料研究水稻的表型生理變化，進一步結合亞細胞和組織定位試驗揭示OsSUT4 在水稻蔗糖轉運中的功能。研究結果可為精確運用生物技術和分子育種技術來改善“源”、“庫”、“流”效率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 亞細胞定位

以日本晴水稻cDNA 為擴增模板，使用設計的正向引物 5′-GGACTAGTCGACCAACGCATCA ATCA-3′和反向引物 5′-GCTCTAGACGTCCCA TCCAGTCAGTATCA-3′將OsSUT4進行擴增，引物兩端酶切位點分別為SpeⅠ和XbaⅠ。將目的基因片段連入克隆載體pMD18-T，轉入DH5α 大腸桿菌，經過測序驗證正確后用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ將切下的目的片段分別連接到中間載體pSAT6-EGFP-N1 上，驗證正確后用限制性內切酶 PI-PspⅠ將目的片段切下來再連入pCAMBIA1305-GFP載體，比對序列選出測序正確的質粒保存待用。使用OSMCA1-RFP 作為質膜標記[14]。按照已發(fā)表的方法[15]提取和轉化水稻原生質體，將水稻種子去殼后進行消毒，置于1/2 MS 培養(yǎng)基中避光培養(yǎng) 14 d 后得到的黃化苗可進行原生質體提取。操作步驟及溶液配方參考鐘英健等[15]。

1.2 pCAMBIA 1300::GUS 轉基因水稻材料的構建及組織定位觀察

以日本晴水稻cDNA 為擴增模板，使用設計的正向引物序列 5′-GGTCGACTTGCATGACTTGA AGCCTGCTG-3′和反向引物序列為 5′-GTCTA GAGGCGGGGCGCAGATCTGGTA-3 ′ 擴 增 出OsSUT4序列的啟動子片段，引物兩端酶切位點分別為BsaI 和EcoR I。將啟動子片段連入克隆載體pMD18-T，轉入DH5α 大腸桿菌，測序正確后，HindⅢ與SacⅠ雙酶切、膠回收再連入pCAMBIA 1300::GUS載體，委托武漢伯遠生物科技有限公司進行轉化，獲得OsSUT4的GUS 轉基因植株材料。

種子發(fā)芽后，用營養(yǎng)液(根據Yoshida 等的配方修改)培養(yǎng)（0.5 mmol/L KNO3; 0.5 mmol/L NH4Cl;0.32 mmol/L NaH2PO4·2H2O; 0.5 mmol/L KCl; 0.011 mmol/L MnCl2·4H2O; 0.0185 mmol/L H3BO3; 0.0006 mmol/L Na2MoO4·2H2O; 0.0014 mmol/L ZnSO4·7H2O; 0.0016 mmol/L CuSO4·5H2O; 0.3 mmol/L MgCl2·6H2O; 0.66 mmol/L CaCl2; 0.0448 mmol/L FeSO4·7H2O; 0.05 mmol/L Na2EDTA·2H2O），調 pH 值至 5.5 左右，每 7 d 更換一次。苗期取pOsSUT4::GUS轉基因植株的根系、葉片和莖鞘；之后將水稻苗在土壤中培養(yǎng)至抽穗揚花期，取花器官。取樣后將其完全浸沒在充分混合了 1 mmol/L x-GLUC 的GUS 染色緩沖液中，打開容器蓋在真空泵中泵30 min，然后蓋上蓋子，靜置在37℃恒溫箱中過夜，從恒溫箱中取出染色的植物組織，去除染色溶液，加入75%乙醇溶液煮沸脫色，直至植物組織樣品變白，在體視顯微鏡下(Olympus SZX16)觀察，并拍照記錄。

1.3 ossut4 缺失突變體材料的構建

利用CRISPR/Cas9 技術構建水稻ossut4突變體材料，設計的靶點序列PAM 為CCTCACGGCCAT CCGCCTGCCCT。以日本晴為遺傳背景，將構建好的載體委托武漢伯遠生物科技有限公司進行轉化，獲得轉基因材料。SDS 法提取 T0代突變體水稻基因組DNA，篩除T-DNA 插入的植株后使用對應的引物進行PCR 擴增，測序并與靶點序列進行比對，確定突變類型（圖 1），挑選出純合突變的植株后繁種保存，用于后續(xù)試驗。

1.4 試驗材料的種植和取樣

供試水稻品種為ossut4純合突變體的三個株系sut4-15-1、sut4-15-2、sut4-46和野生型日本晴。將T2種子和野生型使用 1.5%雙氧水浸種消毒后，在72 孔穴盤中播種育秧，待水稻長至4 葉1 心期，挑選長勢一致的健康幼苗移栽到桶中，每桶4 穴，1 穴1 苗，統(tǒng)一常規(guī)水肥管理?；视谝圃郧耙惶焓┯?，每桶施尿素、磷酸二氫鉀、氯化鉀量分別2.1 g、0.958 g、0.744 g；穗肥于幼穗分化期施用，每桶分別施尿素、磷酸二氫鉀、氯化鉀各2.1 g、0.958 g、0.744 g。水稻盛花期時，采用不同顏色的標牌記錄不同小穗的開花時間。于水稻抽穗前剪取ossut4突變體材料和野生型的劍葉，液氮速凍后放于–80℃冰箱保存，用于基因表達量的測量。于白天結束（18:00）和夜晚結束（6:00）時取ossut4突變體材料和野生型的劍葉，105℃下殺青后放入 80℃烘箱內烘干至恒重，用于淀粉、蔗糖含量的測定。于水稻成熟期對試驗材料進行田間性狀的考查，包括分蘗數、株高等，成熟期取樣后統(tǒng)計產量構成。

1.5 熒光定量檢測

總RNA 提取采用Omega 公司的Plant RNA Kit試劑盒，RNA 濃度和純度測定合格后，反轉錄使用TaKaRa 的 PrimeScript? RT Master Mix 試劑盒并按說明書配制反應體系，RT-PCR 使用 TaKaRa 的SYBR?Premix ExTaq?試劑盒，以Actin為內參，引物序列見表1。每個處理的樣品測定3 個生物學重復，每個生物學重復進行3 次技術重復。

1.6 葉片、籽粒中淀粉、可溶性糖含量的測定

烘干樣品粉碎后過1 mm 篩，稱取0.1 g 粉樣，用80%乙醇在80℃下水浴提取30 min 后5000 r/min下離心15 min，然后轉移上清液至10 mL 容量瓶，重復提取3 次，合并所有上清液至同一容量瓶，用蒸餾水定容后靜置，用于測定可溶性糖濃度。將可溶性糖提取后的殘渣60℃下烘干，加入2 mL 蒸餾水，放入100℃水浴糊化20 min。冷卻后加入2 mL預冷9.2 mol/L HClO4，冰浴條件下間歇震蕩提取15 min，加入6 mL 蒸餾水，然后5000 r/min 下離心15 min，轉移上清液至50 mL 容量瓶，再加入2 mL 9.2 mol/L HClO4重復提取一次，合并兩次上清液至50 mL 容量瓶，用蒸餾水定容，用于測定淀粉濃度。

圖1 ossut4 突變體株系與野生型的序列比對結果Fig. 1. Results of sequence alignment between the ossut4 mutant lines and the wild-type.

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1. Primer sequences of RT-PCR.

采用超高效液相色譜儀測定提取液中蔗糖、葡萄糖、果糖的濃度。蒽酮比色法淀粉濃度，吸取0.1 mL 提取液，加入4 mL 0.2%蒽酮，沸水浴15 min后冷卻，吸取0.2 mL 至酶標板中，使用酶標儀(Nano Quant, infinite M200, Tecan, 瑞士)于 620 nm 波長下測定吸光值。繪制淀粉標準曲線計算淀粉含量。

1.7 葉片光合作用與SPAD 值的測定

于花后7 d 分別選取ossut4突變體和野生型長勢一致的3~5 個標記主莖，在9:00–11:00 用Li-6400型光合儀測定凈光合速率(Pn)，每處理重復 3 次，測定時使用開放式氣路，CO2濃度為380 μmol/mol；選擇紅藍光源葉室，設定光量子密度(PAR)為1500 μmol/(m2·s)。與此同時使用 SPAD-502 型葉綠素計測定植株劍葉的SPAD 值（對葉片上、中、下三個部位讀數取平均值），每處理重復15 次。

1.8 花粉I2-KI 染色和花粉可染率的計算

在即將開花時，每株系取主穗上3 朵比較一致的小穗，用鑷子去除內外穎殼，取出6 個花藥并用鑷子夾碎置于含1% I2-KI 染液的載玻片上，室溫放置5 min，在體視鏡下觀察突變體和野生型花粉的染色情況，染色淺和形狀不規(guī)則的視為不育。每張片子觀察5 個有較多花粉數目的視野，數出總花粉數和敗育花粉數。花粉可染率=(總花粉數–敗育花粉數)/總花粉數×100%。

1.9 灌漿速率的測定

自開花至花后30 d，依次取花后3、6、9、12、15、20、30 dossut4突變體材料和野生型的穗。將樣品置于烘箱中，105℃下殺青30 min，結束后80℃烘干至恒重，稱量籽粒干質量。利用Richards 方程對籽粒灌漿過程進行擬合，計算灌漿速率[16]。

對方程(1)求導，得到灌漿速率R：

以上算式中，B、k、N均為參數。W代表生長勢，即粒重（mg）；A代表生長終止量，即最終粒重；t為開花后的天數（d）。

1.10 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016 對數據進行整理和作圖，并用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計。通過CurveExpert Pro 對籽粒灌漿過程進行Richards 方程擬合。

2 結果與分析

2.1 OsSUT4 突變對水稻株高、分蘗及產量的影響

OsSUT4基因突變后株高顯著降低，與野生型相比，突變體株系sut4-15-1、sut4-15-2和sut4-46的株高分別下降5.8%、6.5%及4.8%(圖2、表2)。突變體株系sut4-15-1、sut4-15-2和sut4-46的分蘗數的增幅分別為 9.9%、8.9%及 7.5%（表 2）。和野生型相比，ossut4突變體每穗粒數、結實率、一次枝梗數、二次枝梗數以及千粒重均顯著降低，下降幅度分別為22.5%、15.9%、19.6%、19.4%及5.0%。

2.2 OsSUT4 突變對水稻葉片OsSUT1、OsSUT3及OsSUT5 相對表達量的影響

圖3 所示，野生型葉片OsSUT4相對表達量最高，顯著高于OsSUT1、OsSUT3和OsSUT5；OsSUT4基因突變后其表達量非常低，降幅達 90%以上；OsSUT4突變體植株葉片的OsSUT1相對表達量下降26.3%，但OsSUT3和OsSUT5的相對表達量則顯著增加，平均為對照的3.3 和7.5 倍。

圖2 OsSUT4 突變對水稻株高的影響Fig. 2. Effects of OsSUT4 mutation on plant height in rice.

表2 OsSUT4 突變對株高和產量構成的影響Table 2. Plant height and yield components of ossut4 mutant and wild type.

2.3 OsSUT4 突變對葉片光合代謝的影響

由圖 4 可知，OsSUT4基因突變后，白天結束時3 個突變體株系蔗糖含量顯著增加，蔗糖含量最高的突變體株系sut4-15-2較野生型增加7.4%，夜晚結束時其蔗糖含量除sut4-15-1株系外呈上升趨勢，其中突變體株系sut4-15-2較野生型增加約8.7%(圖 4-A)。OsSUT4突變體中除sut4-46株系外，淀粉含量在白天結束時和夜晚結束時較野生型均顯著增加，突變體株系sut4-15-1、sut4-15-2在白天結束時淀粉含量增加7.4%、7.9%，夜晚結束時淀粉含量增加8.2%、5.6%(圖4-B)。花后7 d 測定了ossut4突變體株系和野生型的凈光合效率，除sut4-46株系，其他兩個株系較野生型顯著降低（圖 4-C），SPAD 值無顯著差異（圖4-D）。

2.4 OsSUT4 突變對花粉活力的影響

因蔗糖轉運對花粉育性和受精率有影響，研究了OsSUT4基因突變后花粉活力的變化。圖5-A 分別為野生型和ossut4三個突變體花粉I2-KI 染色情況，可以看出ossut4突變體花粉敗育比例更高。由圖 5-B 可知，突變體較野生型花粉可染率降低，sut4-15-1、sut4-15-2和sut4-46三個突變體株系分別下降4.9%、6.5%及3.9%。

2.5 OsSUT4 突變對籽粒灌漿的影響

從野生型和ossut4突變體材料的粒重動態(tài)(圖6-A)和灌漿速率(圖6-B)可看出，ossut4突變體材料的粒重始終低于野生型；花后0~10 d 野生型灌漿速率高于ossut4突變體，花后10~25 dossut4突變體的灌漿速率高于野生型，15 d 左右時所有株系灌漿速率達到最大值。花后5~10 d，ossut4突變體籽粒中果糖含量略低于野生型，而10 d 后，ossut4突變體籽粒中果糖含量逐漸增加，并高于野生型；ossut4突變體與野生型籽粒中葡萄糖含量變化趨勢與果糖相似。ossut4突變體籽粒中蔗糖含量在花后5~10 d 低于野生型，隨著天數的增加，ossut4突變體籽粒中蔗糖含量逐漸升高，而野生型籽粒中蔗糖含量有降低的趨勢（圖6-C~E）。

2.6 OsSUT4 的亞細胞定位和組織定位分析

通過構建OsSUT4::GFP 融合蛋白，轉化水稻原生質體來對OsSUT4進行亞細胞定位。

圖7 結果顯示，OsSUT4 和GFP 的融合蛋白只在細胞質膜上表達，且與質膜標記 OSMCA1-RFP結果完全重合，表明 OsSUT4 定位在細胞質膜上，具備跨膜轉運蔗糖的特征。構建pOsSUT4::GUS轉基因材料研究OsSUT4在不同組織中的表達，對營養(yǎng)生長時期的pOsSUT4::GUS植株的葉片、葉鞘、莖、根以及開花期的小穗，灌漿期的穎果進行染色，進一步對浸種萌發(fā)的籽粒進行了染色，發(fā)現OsSUT4在萌發(fā)種子的胚、胚芽鞘的維管束，葉片和根的維管組織，在開花期穎殼、花梗、花藥，灌漿期穎果的糊粉層中都有表達，在葉鞘中也檢測到GUS 活性（圖7）。

圖4 OsSUT4 突變對水稻蔗糖含量、淀粉含量、凈光合速率和SPAD 值的影響Fig. 4. Effects of OsSUT4 mutation on sucrose, starch contents, photosynthetic rate and SPAD value in rice leaves.

圖5 OsSUT4 突變對水稻花粉活力的影響Fig. 5. Effects of OsSUT4 mutation on pollen vigor in rice.

3 討論

圖6 OsSUT4 突變對水稻籽粒灌漿的影響Fig. 6. Effects of OsSUT4 mutation on grain filling in rice.

圖7 水稻蔗糖轉運蛋白OsSUT4 的亞細胞定位(A-D)和組織定位(E-K)Fig. 7. Sub-cellular localization(A-D) of OsSUT4 and tissue expression(E-K) of pOsSUT4::GUS transgenic rice.

蔗糖是作物產量形成的基礎，水稻葉片光合作用合成的蔗糖需經源端韌皮部裝載、長距離轉運、庫端卸載進入籽粒合成淀粉形成最終產量。植物體內蔗糖的主動運輸主要由SUT 負責完成。水稻基因組中已鑒定出5 個蔗糖轉運蛋白。OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3 和OsSUT5 的功能已有研究報道，OsSUT4的功能尚不清楚。本研究采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術構建了ossut4缺失變體材料，試圖揭示它在水稻生長發(fā)育過程中的功能。研究發(fā)現ossut4突變體植株株高變矮、分蘗數增加，且最終產量降低，表現在每穗粒數、千粒重和結實率降低。ossut4缺失變體表型可能與蔗糖轉運、分配有關，進一步研究了源、庫端的碳水化合物變化。ossut4缺失變體水稻植株葉片中蔗糖、淀粉出現積累，凈光合速率顯著降低，出現了典型的韌皮部裝載受阻表型[17-18]，OsSUT4 的亞細胞定位結果表明其定位在細胞質膜上，具備跨膜轉運蔗糖的特征，證明OsSUT4 參與了水稻韌皮部蔗糖裝載過程。

蔗糖的裝載受到抑制，對庫端籽粒灌漿有何影響？從灌漿初期籽粒的灌漿速率和粒重可以看出，ossut4突變體的灌漿速率和粒重低于野生型，這可能與籽粒糖的卸載供應有關。對籽粒灌漿初期蔗糖的含量進行測定，發(fā)現ossut4突變體灌漿初期蔗糖含量要低于野生型。推測是由于源端葉片蔗糖的裝載受阻，韌皮部轉運量減少，到庫端籽粒的糖卸載量減少導致灌漿初期籽粒糖供應不足，產量降低。隨著灌漿進程的推進，ossut4突變體籽粒中蔗糖出現積累，可能是因其籽粒蔗糖-淀粉轉化效率低，庫活性低導致，這也是下一步研究關注的重點。

從OsSUT4組織定位結果可以看出，其在萌發(fā)種子的胚、胚芽鞘，開花期小穗的穎殼、花梗、花藥，灌漿期穎果的糊粉層中都有表達。前人對pOsSUT3::GUS轉基因水稻植株的研究證實了OsSUT3在花粉發(fā)育中發(fā)揮作用[19]。本研究也發(fā)現OsSUT4在花粉中有表達，當OsSUT4基因突變后其花粉活力顯著下降，影響水稻的受精，導致水稻結實率降低，表明OsSUT4 可能參與了花粉中蔗糖轉運。綜上所述，OsSUT4 在水稻蔗糖轉運過程包括源端裝載以及籽粒庫端卸載等生理過程中起重要作用。