熊濤 聶元元 毛方明 雷建國(guó) 毛凌華 朱珊 黃仁良 沈顯華,* 嚴(yán)松,,*
(1 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心 南昌 330200;2 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 科技管理處 南昌 330200;3 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所 南昌 330200;#共同第一作者;*通信聯(lián)系人,E-mail: yans11@163.com;shen_xh20000913@126.com)
在自然界中,自交不親和性廣泛存在,超過(guò)60%的被子植物具有這種特征,它有利于異花傳粉,從而促進(jìn)遺傳多樣性。與自交不親和對(duì)應(yīng)的異交不親和,其存在更為廣泛。異交不親和性主要存在于異種、異屬間,親緣關(guān)系越遠(yuǎn),不親和性越高,即異交不親和是物種穩(wěn)定的重要保障[1]。植物異交不親和一般發(fā)生在遠(yuǎn)緣種間,種內(nèi)異交不親和則比較罕見(jiàn)。從應(yīng)用角度來(lái)看,發(fā)掘種內(nèi)異交不親和資源并闡明其遺傳機(jī)制,頗具應(yīng)用前景。將異交不親和基因?qū)胱匀黄贩N中,可作為不含該基因的品種(包括轉(zhuǎn)基因)生產(chǎn)繁殖的隔離材料使用;將不親和基因和親和基因分別導(dǎo)入不育系和恢復(fù)系,而周邊種植不含親和基因的材料,則可實(shí)現(xiàn)雜交種制種的生物學(xué)隔離。然而在雜交稻育種中,種內(nèi)的異交不親和卻是影響繁種、制種產(chǎn)量以及生產(chǎn)成本最大的因素之一。
目前,在植物自交不親和性研究方面已取得一系列重要進(jìn)展[2-4],而對(duì)于異交不親和性的研究還比較薄弱,主要因?yàn)楫惤徊挥H和性的遺傳研究相對(duì)較難。如果不親和在兩個(gè)親本中是雙向的,就不能產(chǎn)生后代進(jìn)行遺傳研究,只有單向方可進(jìn)行[5]。
在禾本科作物中,已在玉米和水稻上發(fā)現(xiàn)有單向異交不親和現(xiàn)象。玉米上發(fā)現(xiàn)異交不親和可以追溯到一百多年前,1902 年科學(xué)家Correns 發(fā)現(xiàn)第一個(gè)異交不親和基因Ga1[6],1936 年Burnham 報(bào)道了Ga2[7],之后Ga3~Ga10及Tcb1等多個(gè)單向異交不親和位點(diǎn)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[5,8],目前僅Ga1被克隆報(bào)道。Zhang等對(duì)Ga1位點(diǎn)中的雄性控制基因ZmGa1P進(jìn)行克隆和功能驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)ZmGa1P編碼一個(gè)在Ga1-S和Ga1-M型玉米自交系花藥中特異表達(dá)的果膠甲酯酶,ZmGa1P位于花粉管頂端,與另一個(gè)花粉管特異表達(dá)的 PME 蛋白互作,共同維持花粉管正常的甲酯化修飾程度,以保障花粉管在Ga1-S型花絲中的正常伸長(zhǎng),最終受精結(jié)實(shí)[9]。
作為自花授粉的水稻,異交不親和主要發(fā)生在遠(yuǎn)緣野生種和栽培種以及不同染色體組的野生種之間,這也是生殖隔離的一種表現(xiàn)。2003 年Matsubara 等[10]報(bào)道了野生稻和栽培稻異交不親和的遺傳現(xiàn)象,通過(guò)正反交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單向異交不親和由來(lái)自母本 W593A 的Cif基因和來(lái)自父本 T65wx的cim互作產(chǎn)生,與玉米相似,Cif花粉能給隱性純合的cim母本授粉結(jié)實(shí),而cim花粉不能給顯性純合的Cif母本授粉結(jié)實(shí),兩者都被定位在第6 染色體上,分別位于短臂和著絲粒附近。2008 年,他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Cif其實(shí)存在兩個(gè)不連鎖的位點(diǎn)Cif1和Cif2,都在第6 染色體上,Cif1被定位在標(biāo)記R2291 和 RM204 之間 0.67 Mb 的區(qū)段上,Cif2定位在RG264 和RM3498 之間,兩標(biāo)記相距約18 cM,涵蓋著絲粒區(qū)域,與Cim位置相近[11]??赡芤蚍纸怆y度大,之后未有新進(jìn)展報(bào)道。
我們?cè)跂|鄉(xiāng)野生稻利用過(guò)程中,也發(fā)現(xiàn)了異交不親和現(xiàn)象。20 世紀(jì)80 年代,江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所以東鄉(xiāng)野生稻為細(xì)胞質(zhì)源,采用野栽交和核置換的方法,培育出具有全新恢保關(guān)系的東野型雄性不育系[12],之后通過(guò)多年大量測(cè)交試驗(yàn),直至近年實(shí)現(xiàn)三系配套[13]。然而,在東野型不育系培育過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)部分保持系品種與不育系存在異交不親和現(xiàn)象,這些品種在雜交或回交時(shí),不育株系的異交結(jié)實(shí)率很低,甚至為零而不能繼續(xù)轉(zhuǎn)育。針對(duì)該現(xiàn)象開(kāi)展了初步研究,通過(guò)構(gòu)建不同核質(zhì)背景的材料,探索東野型不育系異交不親和性的形成原因,進(jìn)而對(duì)該性狀進(jìn)行遺傳分析和基因初步定位。
以東野型不育系DY1A及其保持系早秈稻中早35[13]為主要材料。其余水稻材料有粳稻品種02428、秀水 123,秈稻野敗型保持系Ⅱ-32B、金 23B、五豐B,恢復(fù)系華占、R668、廣恢308 和93-11。
利用染色體單片段代換系研究異交不親和性,該單片段代換系由 Ando 等[14]構(gòu)建,以粳稻品種Sasanishiki 為輪回受體、秈稻品種Habataki 為供體,共有 39 個(gè)系[14]。
2014?2019 年,在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的江西南昌和海南三亞兩處試驗(yàn)基地種植,每個(gè)材料種植 6行,每行8 株,株間距為15 cm×20 cm,田間常規(guī)水肥管理。
在不育系盛花期,傍晚將不育系穎殼剪去 1/3至 1/2,保留完整雌蕊,次日取父本花粉對(duì)它充分授粉,套袋防止串粉。對(duì)同一組雜交,每個(gè)父本做3 個(gè)套袋,每個(gè)雜交套袋用2~3 穗不育系。
授粉后15~25 d,考查結(jié)實(shí)率。結(jié)實(shí)率(%)=實(shí)粒數(shù)/總粒數(shù)×100,取各穗結(jié)實(shí)率的平均值,利用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。
根據(jù)代換系群體遺傳圖譜,結(jié)合表型數(shù)據(jù)對(duì)基因進(jìn)行定位,遺傳距離用centiMorgan(cM)表示。
我們通過(guò)分別構(gòu)建同質(zhì)異核系和同核異質(zhì)系,初步探討東野型不育系異交不親和性形成的原因。
首先,我們進(jìn)行了同質(zhì)異核系雜交試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)所使用的東野型不育系DY1A,在與保持系中早35回交轉(zhuǎn)育過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)不親和性。以DY1A 為胞質(zhì)供體,利用 3 個(gè)粳稻(Sasanishiki、02428 和秀水 123)以及 8 個(gè)秈稻(Habataki、廣恢 308、R668、93-11、華占、II-32B、金23B、五豐B)為輪回父本進(jìn)行不育系轉(zhuǎn)育。在雜交當(dāng)代,Sasanishiki 對(duì)DY1A 表現(xiàn)顯著的不親和性,F(xiàn)0結(jié)實(shí)率僅1.5%,其余10 份材料與 DY1A 雜交結(jié)實(shí)正常(>75%)。值得一提的是,東野型敗育胞質(zhì)具有廣保性,所有F1植株的花粉育性和結(jié)實(shí)率均為0。接下來(lái),在回交第1 代,02428、秀水123、華占、93-11、廣恢308、金23B和五豐B 這7 份材料對(duì)DY1A 的雜交結(jié)實(shí)率顯著下降(回交時(shí)對(duì)每個(gè)父本只做了3 個(gè)套袋的回交,所選擇的回交單株數(shù)不大于 3,各回交世代僅計(jì)算平均結(jié)實(shí)率,未能統(tǒng)計(jì)分離比);回交第2 代時(shí),它們的雜交結(jié)實(shí)率繼續(xù)下降。只有Habataki、R668 和Ⅱ-32B 這3 份材料能夠正常轉(zhuǎn)育,各回交世代結(jié)實(shí)正常(表1)。由此得知:1)東野型不育系存在異交不親和現(xiàn)象;2)東野型不育系的異交親和性受核遺傳背景影響。
我們也進(jìn)行了同核異質(zhì)系雜交試驗(yàn)。在上述回交轉(zhuǎn)育過(guò)程中,金23B 和五豐B 與DY1A 在BC2F0的結(jié)實(shí)率分別為5.3%和17.7%,進(jìn)一步回交,BC3F0的結(jié)實(shí)率分別為4.5%和2.2%(表1),表現(xiàn)典型的異交不親和性。而含有野敗型敗育胞質(zhì)的同核異質(zhì)系金23A 和五豐A 與各自保持系雜交結(jié)實(shí)正常,表明東野型不育系的異交不親和性存在細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。
此外,針對(duì)上述Sasanishiki 與DY1A 在雜交當(dāng)代不親和,也進(jìn)行了同核異質(zhì)雜交試驗(yàn),仍以Sasanishiki 為父本,DY1A 的異質(zhì)保持系中早35 作母本,結(jié)果它們雜交結(jié)實(shí)正常,可見(jiàn)兩者的細(xì)胞核是親和的,進(jìn)一步說(shuō)明東野型不育系的細(xì)胞質(zhì)影響了異交親和性。
綜合以上結(jié)果,明確了東野型不育系的異交不親和性由核質(zhì)互作產(chǎn)生。
根據(jù)上述雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),東野型不育系的異交不親和性存在兩種類型,第一種類型(Ⅰ)發(fā)生在雜交當(dāng)代,以Sasanishiki 為代表。第二種類型(Ⅱ)發(fā)生在回交世代,代表品種有 02428、華占等,在BC1F0時(shí)它們就表現(xiàn)出部分不親和,且觀察到結(jié)實(shí)率有分離,隨著回交世代增加,不親和性逐漸凸顯。
將 Sasanishiki 和 Habataki 與 DY1A 雜交,兩者的親和性截然相反,前者不親和,后者親和。進(jìn)而將它們衍生的一套染色體單片段代換系SL401-SL439 分別與DY1A 雜交,統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。結(jié)果,篩選到2 個(gè)雜交親和的代換系(SL426 和SL427),雜交結(jié)實(shí)率均在80%以上,完全正常(圖1)。其余代換系與DY1A 雜交結(jié)實(shí)率均不足10%,大部分代換系雜交幾乎不結(jié)實(shí)。表明Habataki 與DY1A 雜交的親和性有主效因子作用,且位于 SL426 和SL427 所攜帶的代換片段上。
利用親和代換系 SL426 與 Sasanishiki 的 F1及與Sasanishiki 回交的BC1F1分別與DY1A 雜交來(lái)分析異交不親和性Ⅰ的遺傳行為,結(jié)果,F(xiàn)1與DY1A雜交結(jié)實(shí)率為35.9%,表現(xiàn)中間型。BC1F1共35 株與DY1A 雜交,結(jié)實(shí)率表現(xiàn)為差(<5%)和中間型(30%~40%)兩種情況,差和中間型兩種表型株數(shù)分別是17 和18 株,符合1∶1 分離,初步推測(cè)該類型的異交不親和性Ⅰ在細(xì)胞核內(nèi)受單隱性基因控制,暫命名為CI1(t)。F1與 DY1A 雜交的結(jié)實(shí)率為中間型,說(shuō)明CI1(t)的作用可能存在劑量效應(yīng)。
表1 東野型不育系DY1A與11個(gè)品種雜交/回交的結(jié)實(shí)情況Table 1. Seed setting rates of the DW-type CMS DY1A crossing/backcrossing with 11 varieties.
圖 1 DY1A 分別與 Sasanishiki、SL426 和 SL427 雜交的結(jié)實(shí)情況Fig. 1. Seed setting performances of DY1A crossing with Sasanishiki, SL426 and SL427, respectively.
根據(jù)染色體代換系的遺傳圖譜[14],第8 染色體有4 個(gè)單片段代換系,依次為SL425、SL426、SL427和SL428,SL425 與后三者不重疊,SL427 與前后相鄰的代換系SL426和SL428均有重疊片段。其中,SL426 含從 RM6838 到 RM3395 的片段,SL427 覆蓋RM3395-RM5891,兩者在RM3395 所在位置重疊;SL428 覆蓋 RM5767-RM4997,與 SL427 除RM3395 以外的片段重疊。此外,在其他染色體上,SL426 還含有第 5 染色體 RM6517、SL427 含有第 6染色體RM5957、SL428 含有第2 染色體RM3316和第 3 染色體 RM5442 的小片段,這些片段來(lái)自Habataki。第 2、3、5 和 6 染色體的代換系以及 SL428與 DY1A 雜交,結(jié)實(shí)率表型都與輪回親本Sasanishiki 相似,幾乎不結(jié)實(shí),僅 SL426、SL427及供體親本Habataki 三者與DY1A 雜交結(jié)實(shí)正常,因此,將CI1(t)初步定位在 SL426 和SL427 的重疊區(qū)域,位于RM6838 和RM5767 兩個(gè)標(biāo)記之間,與RM3395 連鎖(圖2),前后兩標(biāo)記相距18.3 cM,物理距離約12 Mb,為精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)。
圖2 CI1(t)在第8 染色體上的初步定位Fig. 2. Rough mapping of of CI1(t) on chromosome 8.
Matsubara 等[10]報(bào)道的水稻單向異交不親和僅受核基因控制,授粉后種子發(fā)育退化或皺縮,本研究中的表型與它有所區(qū)別,東野型不育系的異交不親和表現(xiàn)為結(jié)實(shí)率低或不結(jié)實(shí),而且是一種新類型——由核質(zhì)基因互作產(chǎn)生。我們熟知的植物遠(yuǎn)緣雜交不親和,可能有一些就是由核質(zhì)互作產(chǎn)生的。
此前我們利用分子標(biāo)記通過(guò)對(duì)東鄉(xiāng)野生稻居群檢測(cè)發(fā)現(xiàn),只有部分株系含有東野型敗育細(xì)胞質(zhì)[15],因而推測(cè)東野型不育系存在的異交不親和性,可能是含此類細(xì)胞質(zhì)的東鄉(xiāng)野生稻血緣的一種自我保護(hù)機(jī)制,即這些野生稻株系擁有特定的細(xì)胞質(zhì)基因,其他資源與它們雜交,需要帶有與這類細(xì)胞質(zhì)信號(hào)相匹配的親和核基因,才能實(shí)現(xiàn)基因交流。
相比秈稻,我們發(fā)現(xiàn)粳稻在與東野型不育系雜交/回交的較早世代就表現(xiàn)不親和性。在東野型三系雜交稻育種過(guò)程中,我們選用的粳稻品種(>50 份)轉(zhuǎn)育東野型不育系最終幾乎全部表現(xiàn)不親和,而秈稻卻有少數(shù)品種完全親和,表明東野型三系體系不適用于粳稻,而在秈稻上距離生產(chǎn)應(yīng)用仍有很長(zhǎng)的路要走,當(dāng)務(wù)之急是解決東野型不育系異交不親和性的瓶頸問(wèn)題。
本研究發(fā)現(xiàn)的兩種不親和性發(fā)生在不同雜交世代,說(shuō)明它們各自的控制基因可能不同。第一種類型在雜交當(dāng)代出現(xiàn),受單隱性基因控制,并利用單片段代換系群體將其定位在第8 染色體SSR 標(biāo)記RM6838 和RM5767 之間,覆蓋著絲粒區(qū)域,對(duì)后續(xù)精細(xì)定位有一定難度。第二種類型的不親和性在回交一代時(shí)初步體現(xiàn),回交至第二或第三代時(shí)徹底顯現(xiàn),推測(cè)它的遺傳方式也不復(fù)雜,在育種應(yīng)用中對(duì)它們進(jìn)行遺傳改良應(yīng)是可行的。
目前對(duì)水稻異交不親和性的研究比較滯后,主要有兩方面原因。一是主觀因素,科研人員對(duì)這類性狀認(rèn)識(shí)不足,即便遇到也可能誤以為雜交沒(méi)有做好而忽視,因此相關(guān)研究報(bào)道非常少。眾所周知,手工雜交的結(jié)實(shí)率比不上自交。本研究中,DY1A與不同品種雜交、回交的結(jié)實(shí)率變幅很大(0%~88.6%),其中不乏手工雜交沒(méi)有做好的情況。實(shí)際上,影響雜交結(jié)實(shí)率的因素較多,比如授粉時(shí)的花粉數(shù)量和質(zhì)量等,所以在后續(xù)基因定位過(guò)程中,將雜交做好從而準(zhǔn)確鑒定表型十分關(guān)鍵。另一方面是客觀原因,異交不親和不同于其他農(nóng)藝性狀,它需要通過(guò)雜交試驗(yàn)來(lái)判斷表型,比對(duì)一般農(nóng)藝性狀的觀測(cè)多一道程序,若當(dāng)代雜交失敗就意味著要多一個(gè)世代來(lái)確定表型,而且對(duì)于純合與雜合表型區(qū)分不開(kāi)的情況還需要利用后代家系去鑒定。不管怎樣,挖掘異交不親和材料加以研究,無(wú)論對(duì)理論還是應(yīng)用研究都很有價(jià)值。