單曉英 張祥華 王 巖
山東省莒縣中醫(yī)醫(yī)院兒科,山東莒縣 276500
急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)是一種惡性造血系統(tǒng)疾病,其特征在于骨髓祖細胞/前體分化受損和不受控制的克隆擴增,導致骨髓衰竭和正常造血功能受損[1]。AML是成人中最常見的急性白血病,也是兒童中第二常見的白血病。目前,AML的臨床治療仍以聯(lián)合化療為主,但其總體緩解率有限,復發(fā)率也偏高。尤其是老年AML患者,確診后的生存期僅5~10個月[2]。腫瘤細胞的增殖與凋亡涉及到細胞基因組學的改變,其中,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)在此過程中發(fā)揮著重要作用。因LncRNAs可通過表觀遺傳學[3]、轉錄[4]以及轉錄后調控[5]介導基因的表達調控,近年來成為藥物抗腫瘤作用機制研究的熱點。其中,LncRNA-H19是最早報道的LncRNAs之一,其在大多數(shù)成體組織中不表達或低表達,然而,在腦、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)腫瘤中的表達均呈上升趨勢,且其致癌作用機制因腫瘤不同而存在差異[6]。冬凌草是一種唇形科香茶菜屬植物,產(chǎn)于貴州、四川、廣西等地區(qū),在傳統(tǒng)上常用于清熱解毒、消炎止痛、活血等。冬凌草富含貝殼杉烷二萜、三萜、甾體以及揮發(fā)油等成分,尤其是其主要活性成分冬凌草甲素在食管癌[7]、胃癌[8]、結直腸癌[9]、骨肉瘤[10]等惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的抗癌作用且無明顯的毒副作用,因此引起了國內外研究者的廣泛關注[11]。本研究旨在觀察冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響,并探討其作用機制是否與調控LncRNA-H19相關。
人急性髓系白血病細胞HL-60購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫;冬凌草甲素(純度>98%)購于北京環(huán)宇生物技術有限公司,用二甲基亞砜配制成10mmol/L母溶液;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;青霉素、鏈霉素、Lipofectamine 2000、Trizol、RT-PCR試劑盒購于美國Invitrogen公司;CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司;碘化丙錠染料購于美國Sigma公司;兔抗人Caspase-3、兔抗人Bax、兔抗人Bcl-2、兔抗人LC3-Ⅱ、兔抗人Beclin-1單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司。
Real time PCR分析儀購于美國ABI公司;流式細胞儀購自美國Backman公司;電泳儀購于美國Bio-Rad公司。
HL-60細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)(含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素),培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃、飽和濕度。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。
采用Lipofectmine 2000將陰性對照(si-NC組)和LncRNA-H19 siRNA(si-LncRNA-H19組)轉染至HL-60細胞,轉染6h后換新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞,直至48h收取細胞,提取RNA檢測LncRNA-H19表達情況。
采用Trizol試劑提取細胞中的總RNA并逆轉錄合成cDNA,用cDNA作為模板合成擴增目的基因,采用β-actin作為內參照基因。反應條件為95℃預變性30s,95℃變性15s,60℃退火35s,共40個循環(huán)。LncRNA-H19基因的上游引物序列為:5'-CTACAGCTTACTTCAAGGCCAG-3';下 游 引 物序列為5'-TCAGAGACAGTCAAGCGGTAT-3'。
采用CCK-8法檢測HL-60細胞增殖情況,收集處于對數(shù)生長期的HL-60細胞并接種于96孔板上,密度為5×103個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照(Control)組,觀察不同濃度冬凌草甲素(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L)對HL-60細胞增殖的影響;在細胞轉染成功后,用25μmol/L冬凌草甲素處理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞,觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞增殖的影響。培養(yǎng)48h后,每孔加入10μL的CCK8溶液,于37℃持續(xù)孵育2h,再用酶標儀在450nm處檢測吸光度。實驗重復3次。
采用流式細胞術法檢測HL-60細胞的凋亡情況,收集處于對數(shù)生長期的HL-60細胞并接種于6孔板上,密度為5×105個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照(Control)組,觀察不同濃度冬凌草甲素(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L)對HL-60細胞凋亡的影響;在細胞轉染成功后,用25μmol/L冬凌草甲素處理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞,觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞凋亡的影響。培養(yǎng)24h后收集細胞,以1500rpm離心5min,棄上清液,用PBS漂洗3次,棄上清液。再將細胞重懸浮并分別加入10μL的Annexin V-FITC和5μL的碘化丙錠染料,混勻,于25℃避光反應15min,再加入300μL緩沖液于1h內采用流式細胞儀檢測。
采用Western Blot法檢測相關蛋白表達水平。收集處于對數(shù)生長期的HL-60細胞并接種于6孔板上,密度為5×105個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照(Control)組,觀察不同濃度冬凌草甲素(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L)對HL-60細胞中相關蛋白表達的影響;在細胞轉染成功后,用25μmol/L冬 凌 草 甲 素 處 理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞,觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞中相關蛋白表達的影響。培養(yǎng)24h后收集細胞,用RIPA裂解液處理細胞并采用BCA法定量總蛋白濃度。以每孔30μg上樣,聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉液于25℃封閉1h后分別加入 兔 抗 人Caspase-3(1∶1000)、兔 抗 人Bax(1∶1000)、兔抗人Bcl-2(1∶1000)、兔抗人LC3-Ⅱ(1∶1000)、兔抗人Beclin-1(1∶2000)單克隆抗體,于4℃孵育過夜。用TBST漂洗3次后,加入辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG(1∶1000),于37℃孵育30min,用ECL發(fā)光劑顯影。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值,選擇β-actin作為上樣內參。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。
采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以()表示,多組間比較采用One-Way ANOVA分析,兩組獨立樣本比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
在5.0~25.0μmol/L濃度范圍內,HL-60細胞存活率隨著冬凌草甲素濃度的增加而降低,凋亡率隨著冬凌草甲素濃度的增加而升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。
表1 冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響(%)
在5.0~25.0μmol/L濃度范圍內,冬凌草甲素呈濃度依賴性地促進Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達,抑制Bcl-2蛋白表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。
表2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響(±s)
表2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響(±s)
濃度(μmol/L) n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 0(Control) 4 0.70±0.05 0.86±0.05 0.69±0.06 0.60±0.07 0.65±0.06 5.0 4 0.85±0.07 0.71±0.06 0.85±0.07 0.76±0.08 0.85±0.09 10.0 4 0.91±0.11 0.66±0.07 0.92±0.07 0.87±0.09 0.94±0.10 15.0 4 1.04±0.14 0.63±0.07 1.01±0.11 0.92±0.10 0.98±0.12 20.0 4 1.13±0.13 0.60±0.08 1.12±0.09 0.97±0.12 1.13±0.14 25.0 4 1.14±0.15 0.53±0.06 1.42±0.15 1.15±0.14 1.17±0.13 F 6.791 9.532 20.711 9.897 8.977 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
在5.0~25.0μmol/L濃度范圍內,HL-60細胞中LncRNA-H19 mRNA表達量隨著冬凌草甲素濃度的增加而降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。
表3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響(±s)
表3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響(±s)
濃度(μmol/L) n LncRNA-H19表達0(Control) 4 0.98±0.02 5.0 4 0.92±0.03 10.0 4 0.89±0.04 15.0 4 0.82±0.04 20.0 4 0.68±0.04 25.0 4 0.58±0.04 F 56.131 P<0.01
與si-NC組 比 較,si-LncRNA-H19組HL-60細胞存活率明顯降低,細胞凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。
表4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響(± s,%)
表4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響(± s,%)
組別 n 存活率 凋亡率si-NC組 4 46.61±4.25 14.21±1.23 si-LncRNA-H19組 4 37.50±4.04 17.15±1.66 t 2.689 2.462 P 0.036 0.049
與si-NC組 比 較,si-LncRNA-H19組HL-60細胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達增加,Bcl-2蛋白表達減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。
表5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響(±s)
表5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響(±s)
組別 n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 si-NC組 4 1.11±0.13 0.57±0.07 1.41±0.11 1.12±0.11 1.19±0.13 si-LncRNA-H19組 4 1.40±0.14 0.42±0.08 1.67±0.11 1.35±0.10 1.43±0.11 t 2.629 2.528 2.713 2.485 2.622 P 0.039 0.045 0.035 0.047 0.039
現(xiàn)代動物和細胞實驗表明,中藥提取物在惡性腫瘤的防治中具有許多優(yōu)勢,如多靶點作用、副作用少等。冬凌草甲素是一種二萜類化合物,大量的研究表明冬凌草甲素通過誘導細胞周期阻滯、誘發(fā)代謝失衡、調控細胞通路等途徑而抑制惡性腫瘤進展[12-14]。早在2004年,Liu等[15]報道,冬凌草甲素通過降低端粒酶活性,呈時間和濃度依賴性地抑制HL-60細胞生長,并顯著誘導細胞凋亡。此后,Weng等[16]通過研究證實冬凌草甲素通過抑制miRNA-17和miRNA-20a啟 動HL-60細 胞 凋亡程序。Li等[17]通過研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素聯(lián)合丙戊酸協(xié)同抑制HL-60細胞增殖,通過激活內源性凋亡途徑誘導Caspase依賴性凋亡,并引起細胞中Bcl-2/Bax比例下調。本研究通過CCK-8法以及流式細胞術發(fā)現(xiàn)不同濃度的冬凌草甲素對HL-60細胞增殖均有一定的抑制作用,并能有效誘導HL-60細胞凋亡,再次證實了冬凌草甲素在急性髓系白血病中具有明顯的抗腫瘤作用。
Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行分子,其在接受上游Caspase分子信號后而被激活,通過裂解細胞漿、細胞核底物引起細胞凋亡,與凋亡中的染色質凝集、核固縮以及核碎裂等形態(tài)學變化密切相關[18]。Bcl-2家族是另一類調控細胞凋亡的重要分子,其中,抗凋亡成員Bcl-2和促凋亡成員Bax是國內外研究者引用最多的兩個凋亡指標。然而,Bcl-2家族中促凋亡和抗凋亡成員之間比例的異常升高,可導致線粒體外膜通透性增加,刺激膜間隙蛋白釋放,并激活其下游的Caspases級聯(lián)反應,從而啟動細胞凋亡程序[19]。將冬凌草甲素作用于HL-60細胞后,細胞中的Caspase-3和Bax蛋白表達增加,Bcl-2蛋白表達減少,因此,可推測冬凌草甲素誘導HL-60細胞凋亡可能與其調控細胞內Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達,激活線粒體凋亡途徑相關。
自噬是真核細胞內廣泛存在的高度保守的生命現(xiàn)象,是細胞在饑餓、缺氧等應激環(huán)境中通過自我分解變形、受損或喪失功能的蛋白質和細胞器以維持細胞基因組穩(wěn)定以及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種方式,它既是細胞的自我保護機制,也是細胞的程序性死亡機制[20]。LC3-Ⅱ和Beclin-1是應用最多的自噬標志物。LC3-Ⅱ定位于自噬前體和自噬體,可被水解酶水解,其表達水平與自噬體數(shù)量成正比,并可反映自噬活性[21]。Beclin-1是自噬基因Ata6的同源基因,介導自噬蛋白定位于自噬泡并促進自噬體的形成與成熟,被視為自噬的直接執(zhí)行者[22]。Yao等[12]通過LC3-Ⅱ檢測和透射電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素通過抑制p53突變,干擾結直腸癌細胞中的葡萄糖代謝而誘導細胞自噬。葉利洪等[23]報道,冬凌草甲素可誘導人前列腺癌PC-3細胞中自噬相關蛋白Beclin-1表達。在纖維肉瘤中,冬凌草甲素通過誘導誘導內源性NO的生成,激活NO-ERKp53信號通路,從而介導肉瘤細胞的自噬,發(fā)揮抗腫瘤作用[24]。在本研究中,采用不同濃度的冬凌草甲素處理HL-60細胞后,細胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平均明顯升高,表明冬凌草甲素可促進HL-60細胞自噬的增加。
LncRNA是一類由RNA聚合酶Ⅱ轉錄的長度大于200個核苷酸的RNA分子,無明顯的開放閱讀框且?guī)缀鯚o編碼蛋白功能。近年來,隨著高通量轉錄組測序等技術的發(fā)展,越來越多的LncRNA被確證為急性髓系白血病的診斷、預后分子靶標,其中,LncRNA-H19是研究熱點之一。王彩霞等[25]通過MTT染色法以及流式細胞術初期確定LncRNA-H19具有調控急性髓系白血病細胞增殖和凋亡功能。Zhao等[26]通 過 研 究 發(fā) 現(xiàn),LncRNA-H19在 急 性髓系白血病患者骨髓中異常高表達,而LncRNAH19可通過競爭性結合has-miRNA-19a和hasmiRNA-19調控細胞中DNA結合抑制劑2表達而促進細胞增殖。在本研究中,HL-60細胞經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素處理后,細胞中的LncRNA-H19 mRNA表達均明顯明顯降低,說明冬凌草甲素對HL-60細胞中的LncRNA-H19表達具有抑制作用。再進一步采用siRNA技術沉默LncRNA-H19的表達后,HL-60細胞細胞增殖率顯著降低,凋亡率顯著增加,Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達顯著上調,Bcl-2的表達顯著下調,提示LncRNA-H19低表達與冬凌草甲素具有協(xié)同抑制HL-60細胞增殖,促進HL-60細胞凋亡和自噬作用。
總而言之,本研究首次證實了冬凌草甲素通過抑制HL-60細胞中LncRNA-H19的表達而增加細胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達,減少細胞中Bcl-2的表達,進而發(fā)揮抑制細胞增殖,促細胞凋亡、自噬作用。