單曉英 張祥華 王 巖

山東省莒縣中醫(yī)醫(yī)院兒科，山東莒縣 276500

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種惡性造血系統(tǒng)疾病，其特征在于骨髓祖細胞/前體分化受損和不受控制的克隆擴增，導致骨髓衰竭和正常造血功能受損[1]。AML是成人中最常見的急性白血病，也是兒童中第二常見的白血病。目前，AML的臨床治療仍以聯(lián)合化療為主，但其總體緩解率有限，復發(fā)率也偏高。尤其是老年AML患者，確診后的生存期僅5～10個月[2]。腫瘤細胞的增殖與凋亡涉及到細胞基因組學的改變，其中，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）在此過程中發(fā)揮著重要作用。因LncRNAs可通過表觀遺傳學[3]、轉錄[4]以及轉錄后調控[5]介導基因的表達調控，近年來成為藥物抗腫瘤作用機制研究的熱點。其中，LncRNA-H19是最早報道的LncRNAs之一，其在大多數(shù)成體組織中不表達或低表達，然而，在腦、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)腫瘤中的表達均呈上升趨勢，且其致癌作用機制因腫瘤不同而存在差異[6]。冬凌草是一種唇形科香茶菜屬植物，產(chǎn)于貴州、四川、廣西等地區(qū)，在傳統(tǒng)上常用于清熱解毒、消炎止痛、活血等。冬凌草富含貝殼杉烷二萜、三萜、甾體以及揮發(fā)油等成分，尤其是其主要活性成分冬凌草甲素在食管癌[7]、胃癌[8]、結直腸癌[9]、骨肉瘤[10]等惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的抗癌作用且無明顯的毒副作用，因此引起了國內外研究者的廣泛關注[11]。本研究旨在觀察冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機制是否與調控LncRNA-H19相關。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人急性髓系白血病細胞HL-60購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；冬凌草甲素（純度＞98%）購于北京環(huán)宇生物技術有限公司，用二甲基亞砜配制成10mmol/L母溶液；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素、Lipofectamine 2000、Trizol、RT-PCR試劑盒購于美國Invitrogen公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司；碘化丙錠染料購于美國Sigma公司；兔抗人Caspase-3、兔抗人Bax、兔抗人Bcl-2、兔抗人LC3-Ⅱ、兔抗人Beclin-1單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司。

1.2 主要儀器

Real time PCR分析儀購于美國ABI公司；流式細胞儀購自美國Backman公司；電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

HL-60細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)（含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素），培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃、飽和濕度。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4 細胞轉染

采用Lipofectmine 2000將陰性對照（si-NC組）和LncRNA-H19 siRNA（si-LncRNA-H19組）轉染至HL-60細胞，轉染6h后換新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞，直至48h收取細胞，提取RNA檢測LncRNA-H19表達情況。

1.5 LncRNA-H19表達檢測

采用Trizol試劑提取細胞中的總RNA并逆轉錄合成cDNA，用cDNA作為模板合成擴增目的基因，采用β-actin作為內參照基因。反應條件為95℃預變性30s，95℃變性15s，60℃退火35s，共40個循環(huán)。LncRNA-H19基因的上游引物序列為：5'-CTACAGCTTACTTCAAGGCCAG-3'；下 游 引 物序列為5'-TCAGAGACAGTCAAGCGGTAT-3'。

1.6 細胞增殖檢測

采用CCK-8法檢測HL-60細胞增殖情況，收集處于對數(shù)生長期的HL-60細胞并接種于96孔板上，密度為5×103個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照（Control）組，觀察不同濃度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）對HL-60細胞增殖的影響；在細胞轉染成功后，用25μmol/L冬凌草甲素處理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞，觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞增殖的影響。培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL的CCK8溶液，于37℃持續(xù)孵育2h，再用酶標儀在450nm處檢測吸光度。實驗重復3次。

1.7 細胞凋亡檢測

采用流式細胞術法檢測HL-60細胞的凋亡情況，收集處于對數(shù)生長期的HL-60細胞并接種于6孔板上，密度為5×105個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照（Control）組，觀察不同濃度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）對HL-60細胞凋亡的影響；在細胞轉染成功后，用25μmol/L冬凌草甲素處理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞，觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞凋亡的影響。培養(yǎng)24h后收集細胞，以1500rpm離心5min，棄上清液，用PBS漂洗3次，棄上清液。再將細胞重懸浮并分別加入10μL的Annexin V-FITC和5μL的碘化丙錠染料，混勻，于25℃避光反應15min，再加入300μL緩沖液于1h內采用流式細胞儀檢測。

1.8 相關蛋白表達檢測

采用Western Blot法檢測相關蛋白表達水平。收集處于對數(shù)生長期的HL-60細胞并接種于6孔板上，密度為5×105個細胞/孔。先以溶媒二甲基亞砜作為對照（Control）組，觀察不同濃度冬凌草甲素（5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L）對HL-60細胞中相關蛋白表達的影響；在細胞轉染成功后，用25μmol/L冬 凌 草 甲 素 處 理si-NC組和si-LncRNA-H19組細胞，觀察LncRNA-H19 siRNA對HL-60細胞中相關蛋白表達的影響。培養(yǎng)24h后收集細胞，用RIPA裂解液處理細胞并采用BCA法定量總蛋白濃度。以每孔30μg上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉液于25℃封閉1h后分別加入 兔 抗 人Caspase-3（1∶1000）、兔 抗 人Bax（1∶1000）、兔抗人Bcl-2（1∶1000）、兔抗人LC3-Ⅱ（1∶1000）、兔抗人Beclin-1（1∶2000）單克隆抗體，于4℃孵育過夜。用TBST漂洗3次后，加入辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG（1∶1000），于37℃孵育30min，用ECL發(fā)光劑顯影。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，選擇β-actin作為上樣內參。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，兩組獨立樣本比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響

在5.0～25.0μmol/L濃度范圍內，HL-60細胞存活率隨著冬凌草甲素濃度的增加而降低，凋亡率隨著冬凌草甲素濃度的增加而升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 冬凌草甲素對HL-60細胞增殖和凋亡的影響（%）

2.2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響

在5.0～25.0μmol/L濃度范圍內，冬凌草甲素呈濃度依賴性地促進Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達，抑制Bcl-2蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

表2 冬凌草甲素對HL-60細胞中凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

濃度（μmol/L） n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 0（Control） 4 0.70±0.05 0.86±0.05 0.69±0.06 0.60±0.07 0.65±0.06 5.0 4 0.85±0.07 0.71±0.06 0.85±0.07 0.76±0.08 0.85±0.09 10.0 4 0.91±0.11 0.66±0.07 0.92±0.07 0.87±0.09 0.94±0.10 15.0 4 1.04±0.14 0.63±0.07 1.01±0.11 0.92±0.10 0.98±0.12 20.0 4 1.13±0.13 0.60±0.08 1.12±0.09 0.97±0.12 1.13±0.14 25.0 4 1.14±0.15 0.53±0.06 1.42±0.15 1.15±0.14 1.17±0.13 F 6.791 9.532 20.711 9.897 8.977 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響

在5.0～25.0μmol/L濃度范圍內，HL-60細胞中LncRNA-H19 mRNA表達量隨著冬凌草甲素濃度的增加而降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響（±s）

表3 冬凌草甲素對HL-60細胞中LncRNA-H19表達的影響（±s）

濃度（μmol/L） n LncRNA-H19表達0（Control） 4 0.98±0.02 5.0 4 0.92±0.03 10.0 4 0.89±0.04 15.0 4 0.82±0.04 20.0 4 0.68±0.04 25.0 4 0.58±0.04 F 56.131 P＜0.01

2.4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組 比 較，si-LncRNA-H19組HL-60細胞存活率明顯降低，細胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響（± s，%）

表4 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的HL-60細胞增殖和凋亡的影響（± s，%）

組別 n 存活率 凋亡率si-NC組 4 46.61±4.25 14.21±1.23 si-LncRNA-H19組 4 37.50±4.04 17.15±1.66 t 2.689 2.462 P 0.036 0.049

2.5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響

與si-NC組 比 較，si-LncRNA-H19組HL-60細胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

表5 沉默LncRNA-H19表達對冬凌草甲素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達的影響（±s）

組別 n Caspase-3 Bcl-2 Bax LC3-Ⅱ Beclin-1 si-NC組 4 1.11±0.13 0.57±0.07 1.41±0.11 1.12±0.11 1.19±0.13 si-LncRNA-H19組 4 1.40±0.14 0.42±0.08 1.67±0.11 1.35±0.10 1.43±0.11 t 2.629 2.528 2.713 2.485 2.622 P 0.039 0.045 0.035 0.047 0.039

3 討論

現(xiàn)代動物和細胞實驗表明，中藥提取物在惡性腫瘤的防治中具有許多優(yōu)勢，如多靶點作用、副作用少等。冬凌草甲素是一種二萜類化合物，大量的研究表明冬凌草甲素通過誘導細胞周期阻滯、誘發(fā)代謝失衡、調控細胞通路等途徑而抑制惡性腫瘤進展[12-14]。早在2004年，Liu等[15]報道，冬凌草甲素通過降低端粒酶活性，呈時間和濃度依賴性地抑制HL-60細胞生長，并顯著誘導細胞凋亡。此后，Weng等[16]通過研究證實冬凌草甲素通過抑制miRNA-17和miRNA-20a啟 動HL-60細 胞 凋亡程序。Li等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素聯(lián)合丙戊酸協(xié)同抑制HL-60細胞增殖，通過激活內源性凋亡途徑誘導Caspase依賴性凋亡，并引起細胞中Bcl-2/Bax比例下調。本研究通過CCK-8法以及流式細胞術發(fā)現(xiàn)不同濃度的冬凌草甲素對HL-60細胞增殖均有一定的抑制作用，并能有效誘導HL-60細胞凋亡，再次證實了冬凌草甲素在急性髓系白血病中具有明顯的抗腫瘤作用。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行分子，其在接受上游Caspase分子信號后而被激活，通過裂解細胞漿、細胞核底物引起細胞凋亡，與凋亡中的染色質凝集、核固縮以及核碎裂等形態(tài)學變化密切相關[18]。Bcl-2家族是另一類調控細胞凋亡的重要分子，其中，抗凋亡成員Bcl-2和促凋亡成員Bax是國內外研究者引用最多的兩個凋亡指標。然而，Bcl-2家族中促凋亡和抗凋亡成員之間比例的異常升高，可導致線粒體外膜通透性增加，刺激膜間隙蛋白釋放，并激活其下游的Caspases級聯(lián)反應，從而啟動細胞凋亡程序[19]。將冬凌草甲素作用于HL-60細胞后，細胞中的Caspase-3和Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，因此，可推測冬凌草甲素誘導HL-60細胞凋亡可能與其調控細胞內Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達，激活線粒體凋亡途徑相關。

自噬是真核細胞內廣泛存在的高度保守的生命現(xiàn)象，是細胞在饑餓、缺氧等應激環(huán)境中通過自我分解變形、受損或喪失功能的蛋白質和細胞器以維持細胞基因組穩(wěn)定以及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種方式，它既是細胞的自我保護機制，也是細胞的程序性死亡機制[20]。LC3-Ⅱ和Beclin-1是應用最多的自噬標志物。LC3-Ⅱ定位于自噬前體和自噬體，可被水解酶水解，其表達水平與自噬體數(shù)量成正比，并可反映自噬活性[21]。Beclin-1是自噬基因Ata6的同源基因，介導自噬蛋白定位于自噬泡并促進自噬體的形成與成熟，被視為自噬的直接執(zhí)行者[22]。Yao等[12]通過LC3-Ⅱ檢測和透射電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素通過抑制p53突變，干擾結直腸癌細胞中的葡萄糖代謝而誘導細胞自噬。葉利洪等[23]報道，冬凌草甲素可誘導人前列腺癌PC-3細胞中自噬相關蛋白Beclin-1表達。在纖維肉瘤中，冬凌草甲素通過誘導誘導內源性NO的生成，激活NO-ERKp53信號通路，從而介導肉瘤細胞的自噬，發(fā)揮抗腫瘤作用[24]。在本研究中，采用不同濃度的冬凌草甲素處理HL-60細胞后，細胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平均明顯升高，表明冬凌草甲素可促進HL-60細胞自噬的增加。

LncRNA是一類由RNA聚合酶Ⅱ轉錄的長度大于200個核苷酸的RNA分子，無明顯的開放閱讀框且?guī)缀鯚o編碼蛋白功能。近年來，隨著高通量轉錄組測序等技術的發(fā)展，越來越多的LncRNA被確證為急性髓系白血病的診斷、預后分子靶標，其中，LncRNA-H19是研究熱點之一。王彩霞等[25]通過MTT染色法以及流式細胞術初期確定LncRNA-H19具有調控急性髓系白血病細胞增殖和凋亡功能。Zhao等[26]通 過 研 究 發(fā) 現(xiàn)，LncRNA-H19在 急 性髓系白血病患者骨髓中異常高表達，而LncRNAH19可通過競爭性結合has-miRNA-19a和hasmiRNA-19調控細胞中DNA結合抑制劑2表達而促進細胞增殖。在本研究中，HL-60細胞經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素處理后，細胞中的LncRNA-H19 mRNA表達均明顯明顯降低，說明冬凌草甲素對HL-60細胞中的LncRNA-H19表達具有抑制作用。再進一步采用siRNA技術沉默LncRNA-H19的表達后，HL-60細胞細胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著增加，Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達顯著上調，Bcl-2的表達顯著下調，提示LncRNA-H19低表達與冬凌草甲素具有協(xié)同抑制HL-60細胞增殖，促進HL-60細胞凋亡和自噬作用。

總而言之，本研究首次證實了冬凌草甲素通過抑制HL-60細胞中LncRNA-H19的表達而增加細胞中Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達，減少細胞中Bcl-2的表達，進而發(fā)揮抑制細胞增殖,促細胞凋亡、自噬作用。