徐鵬，趙建珍，閆偉偉，羅慧玉，陳佳琛，劉慧

(張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 張家口，075000)

甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑是一類(lèi)具有高效、廣譜、促生的新型仿生性殺菌劑，對(duì)子囊菌綱、半知菌綱和卵菌綱等真菌引起的病害有高效的殺菌活性[1]。它對(duì)苯甲酰胺類(lèi)、二羧酰胺類(lèi)和苯并吡唑類(lèi)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的菌株有效，已成為繼苯丙咪唑類(lèi)和三唑類(lèi)殺菌劑之后極具市場(chǎng)的一類(lèi)殺菌劑[2]。關(guān)于甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的殘留檢測(cè)方法有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[3-7]。GB 23200.54—2016也使用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定了11種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑[8]。

近年來(lái)QuEChERS方法廣泛應(yīng)用于食品樣品的前處理和凈化過(guò)程中[9-13]。許秀敏等[14]采用QuEChERS凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)果蔬中35種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)和三唑類(lèi)殺菌劑的殘留量。在GB 23200.54—2016中前處理方法采用凝膠色譜凈化，與之相比較，QuEChERS前處理技術(shù)分析速度快、有機(jī)溶劑使用量少、污染小、操作簡(jiǎn)便。本研究以QuEChERS前處理方法為基礎(chǔ)通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)和C18以及石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)的組合用量，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry， GC-MS/MS)建立了一種高效、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定番茄中9種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8040氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司;高速冷凍離心機(jī),美國(guó) Thermo Fisher公司;漩渦振蕩器,上海一恒科學(xué)儀器有限公司,氮吹濃縮儀天津恒奧科技發(fā)展有限公司。

丙酮、乙腈，均為色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司;N-丙基乙二胺(40～60 μm)、C18(40 μm)、石墨化炭黑(38～120 μm)，天津博納艾杰爾科技公司;9種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品,純度均大于99%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取9種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用丙酮定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的儲(chǔ)備液，密封后避光儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2 樣品的制備、提取和凈化

取番茄樣品切碎，用搗碎機(jī)搗碎成漿狀，混勻，裝入樣品袋，標(biāo)記，密封備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品10.0 g，置于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈、4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉及陶瓷均質(zhì)子旋渦混勻1 min，超聲提取10 min，5000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于含有900 mg MgSO4，250 mg PSA，200 mg C18，25 mg GCB的15 mL離心管中，漩渦1 min，4000 r/min離心5 min，取上清液2 mL于 40 ℃氮吹濃縮儀吹至盡干，用1 mL丙酮復(fù)溶，若溶液渾濁過(guò)0.22 μm濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜：進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣:高純He；碰撞氣:高純Ar，純度≥99.999%；柱流量1.0 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比3∶1；色譜柱SH-Rtx-5 SilMS；毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm(內(nèi)徑)，膜厚0.25 μm。程序升溫：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，以10 ℃/min升至300 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件：色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃；電離方式EI；電離能量70 e ；離子源溫度200 ℃；檢測(cè)器電壓 0.7 k ；測(cè)定方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring,MRM)；定量、定性離子、碰撞電壓參考表1。

表1 九種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of 9 strobilurin fungicides

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電子轟擊離子源(EI)檢測(cè)模式下對(duì)9種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析(Q3Scan)，分別找到各個(gè)化合物的前體離子，設(shè)定3～45 e 的碰撞能量，對(duì)選定的前體離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(產(chǎn)物離子掃描)，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖，選擇合適的定量離子對(duì)和定性離子對(duì)。使用優(yōu)化條件后的氣相色譜采集9種化合物的MRM質(zhì)譜圖如圖1所示。

圖1 九種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.1 Chromatograms of 9 strobilurin fungicides standard solution

2.2 凈化條件的優(yōu)化

圖2 GCB質(zhì)量對(duì)加標(biāo)回收率的影響Fig.2 Effect of GCB addition on reco ery

圖3 PSA質(zhì)量對(duì)加標(biāo)回收率的影響Fig.3 Effect of PSA addition on reco ery

圖4 C18質(zhì)量對(duì)加標(biāo)回收率的影響Fig.4 Effect of C18 addition on reco ery

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化吸附凈化劑的用量

正交試驗(yàn)可在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，有效評(píng)估各吸附劑之間的交互作用的大小，優(yōu)化吸附劑用量，提高回收率[17]。以空白基質(zhì)加標(biāo)回收率為指標(biāo)，對(duì)GCB(A)、C18(B)、PSA(C)3個(gè)因素進(jìn)行考察，各因素均確定3個(gè)水平，因素與水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平 單位：mg

由表3可知，啶氧菌酯、嘧螨酯、醚菌酯和肟醚菌胺的最優(yōu)凈化組合為A2B1C3；E-苯氧菌酯、肟菌酯和醚菌胺的最優(yōu)凈化組合為A2B3C3；E-苯氧菌酯的最優(yōu)凈化組合為A2B2C3；嘧菌酯的最優(yōu)凈化組合為A3B1C3。其中，啶氧菌酯、嘧螨酯、醚菌酯和肟醚菌胺中雖然B1>B3，但其差值較小，而在E-苯氧菌酯、肟菌酯和醚菌胺3種化合物中，B1與B3差值較大，影響明顯，故綜合考慮，確定最優(yōu)凈化組合為A2B3C3，即凈化劑的配比為GCB的質(zhì)量為25 mg，C18的質(zhì)量為200 mg，PSA的質(zhì)量為250 mg時(shí)，9種化合物中大部分的回收率出現(xiàn)最大值，故確定其為最佳凈化組合。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 單位：%

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)指樣品處理過(guò)程中除目標(biāo)化合物外，其他組分對(duì)定量分析準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的影響[18]。ME采用公式(1)計(jì)算：

ME=km/k

(1)

式中：km為基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率;k為溶劑校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。

本研究采用提取后加入法和絕對(duì)基質(zhì)相應(yīng)法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[19-20]。參照1.2提取空白番茄基質(zhì)溶液。分別用丙酮和空白基質(zhì)溶液配制相同濃度的工作液，按1.3條件進(jìn)行分析測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線(xiàn)和溶劑校準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。ME值為1.27～3.02，表明存在基質(zhì)效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，以減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.5 方法的線(xiàn)性范圍和檢出限

如表4所示，采用優(yōu)化后的提取和凈化方法，將配制的工作液用處理后的空白番茄基質(zhì)逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥上盗星€(xiàn)工作液。以濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線(xiàn)。9 種殺菌劑在5～800 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為 0.993 9～0.999 5，檢出限為 0.5～2.5 μg/kg，定量限為2～8 μg/kg。

表4 九種化合物線(xiàn)性方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限和定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients，LODs and LOQs of 9 strobilurin fungicides

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度

以空白基質(zhì)加標(biāo)回收率表示方法的準(zhǔn)確度，以回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示方法的精密度。選擇3個(gè)不同添加水平測(cè)定，按1.2進(jìn)行樣品制備，按1.3條件分析測(cè)定，并將峰面積帶入工作曲線(xiàn)方程計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,如表5所示。9種甲氧基丙烯酸類(lèi)殺菌劑加標(biāo)回收率為73.24%～91.38%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.51%～10.18%。

表5 平均回收率和平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)Table 5 A erage reco eries and RSDs of 9 strobilurin fungicides

3 結(jié)論

本文采用了QuEChERS提取凈化方式，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳凈化組合，確定以GCB的質(zhì)量為25 mg，C18的質(zhì)量為200 mg，PSA的質(zhì)量為250 mg為最佳凈化劑組合，結(jié)合GC-MS/MS方法，建立了番茄中9種甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑殘留量的測(cè)定方法，同時(shí)經(jīng)基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線(xiàn)法校正，補(bǔ)償了番茄中基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物的影響，滿(mǎn)足食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。該方法代替了國(guó)標(biāo)中凝膠色譜的前處理凈化過(guò)程，降低了乙酸乙酯和環(huán)己烷等有機(jī)溶劑的使用，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，環(huán)境友好，成本低廉，為果蔬中甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑殘留的分析檢測(cè)提供了技術(shù)參考。