張文娟，澹臺(tái)瑋，李敏康，蔡露陽(yáng)，徐秦峰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,國(guó)家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，陜西 西安，710021)

乳是兒童和成年人健康生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來源之一[1]。由于乳制品需求的增加和供應(yīng)鏈的全球化，某些供應(yīng)商為追求經(jīng)濟(jì)利益，常在乳制品中摻入一些不易區(qū)分、同源性更高的動(dòng)物源性產(chǎn)品和原料來降低成本，其中最常見的摻假形式是在高值羊乳中摻入低值牛乳[2-3]。這種摻假行為不僅會(huì)影響行業(yè)健康發(fā)展，也更容易增加過敏的風(fēng)險(xiǎn)[4-7]。因此，檢測(cè)此類產(chǎn)品的摻假情況對(duì)核實(shí)食品標(biāo)簽成分，保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益等具有重要意義。

鑒別牛、羊乳品質(zhì)有蛋白水平、脂肪水平和核酸水平上的方法[8]，相比而言，核酸分子水平上的檢測(cè)穩(wěn)定性更高[9]，且DNA具有很強(qiáng)的種屬特異性，使其被越來越多地用于乳制品的檢測(cè)中。已有的核酸水平上的檢測(cè)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)[10-11]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高分辨率熔解曲線(PCR-high resolution melting，PCR-HRM)[12-14]、單重實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)[15]等。常規(guī)的PCR技術(shù)，依賴于昂貴的熱循環(huán)儀器，而LAMP技術(shù)只需恒溫水浴鍋，但單重LAMP技術(shù)在檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)時(shí)需要進(jìn)行大量繁瑣、重復(fù)性的工作，難以滿足當(dāng)今用戶需求。隨著核酸分子技術(shù)的快速發(fā)展，在食品及乳制品的檢測(cè)中多重檢測(cè)可滿足一次反應(yīng)多靶標(biāo)擴(kuò)增，快速對(duì)現(xiàn)場(chǎng)大量的復(fù)雜樣品及未知樣品做出驗(yàn)證。KIM等[16]基于熒光探針法建立了雙重實(shí)時(shí)LAMP技術(shù)對(duì)牛奶和羊奶進(jìn)行檢測(cè)，但是不同的靶標(biāo)需要合成不同的熒光標(biāo)記探針，使得成本增高。

HRM是基于飽和熒光染料發(fā)展起來的一種新型PCR檢測(cè)技術(shù)，在普通熔解曲線的基礎(chǔ)上依據(jù)更小的熔解溫度差異鑒別不同的目的基因，并依靠特殊儀器獲得更高密度數(shù)據(jù)值。GANOPOULOS[17]使用PCR-HRM技術(shù)檢測(cè)出羊乳奶酪中的牛乳成分，為該技術(shù)在乳及乳制品的摻假檢測(cè)應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ)。本研究針對(duì)奶牛和奶山羊線粒體DNA設(shè)計(jì)LAMP特異性引物，通過對(duì)不同引物比例及反應(yīng)溫度的優(yōu)化，利用HRM技術(shù)對(duì)Tm值差異較小的牛羊乳擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確有效區(qū)分，實(shí)現(xiàn)了羊乳中摻入牛乳成分的檢測(cè)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮牛乳樣品采集于陜西省西安市未央?yún)^(qū)某奶牛場(chǎng)，新鮮羊乳樣品采集于未央?yún)^(qū)某市場(chǎng)農(nóng)戶處，樣品存于-20 ℃冰箱備用;其他用于驗(yàn)證引物特異性DNA(雞、豬、馬、兔、鴨、狗和貓)樣本購(gòu)買于四川華漢三創(chuàng)有限公司;其他不同類型全脂羊奶產(chǎn)品、低脂羊奶產(chǎn)品、羊奶片等實(shí)際樣品隨機(jī)購(gòu)買于大型商場(chǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑

磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒，天根有限公司；甜菜堿，Sigma公司；dNTP混合液、Bst 2.0 Warm Star DNA聚合酶和MgSO4等，NEB公司。

1.2.2 儀器

熒光定量PCR儀(MyGo Pro)，IT-IS Life Science Ltd；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Qtower 2.2)，德國(guó)耶拿公司；電熱恒溫水槽(DK-8D)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)(5424R)，Eppendorf 有限公司；超微量分光光度計(jì)(Q6000)，美國(guó)Quawell。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA的提取

按照磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒說明書對(duì)上述新鮮乳品或羊乳制品中的DNA進(jìn)行提取。使用超微量核酸定量?jī)x測(cè)定鮮牛乳、鮮羊乳DNA質(zhì)量濃度，將溶液稀釋到7 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.科學(xué)制定實(shí)施方案。2017年，山西農(nóng)墾依據(jù)中央政策，結(jié)合調(diào)查摸底情況和我省實(shí)際，多次征求各市農(nóng)墾主管部門及26個(gè)農(nóng)場(chǎng)和省編辦的意見，由省農(nóng)業(yè)廳、財(cái)政廳、教育廳、衛(wèi)生和計(jì)劃委員會(huì)、民政廳、中國(guó)人民銀行太原中心支行共同研究起草了《山西省農(nóng)墾國(guó)有農(nóng)場(chǎng)辦社會(huì)職能改革實(shí)施方案》，進(jìn)一步明確了工作原則、改革內(nèi)容、實(shí)施步驟及責(zé)任分工。之后，有改革任務(wù)的各市縣也分別制定了符合自身實(shí)際的辦社會(huì)職能改革實(shí)施方案。

2.2 LAMP引物設(shè)計(jì)及篩選

參考SN/T 4419.21—2016[18]標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道的引物序列[19]，以牛、羊線粒體保守序列為靶基因，并在PrimerExplorer 5網(wǎng)站進(jìn)行多次篩選比對(duì)來合成LAMP特異性引物，如表1所示。LAMP引物由生工生物(上海)有限公司合成并經(jīng)高效液相色譜純化。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的LAMP引物序列Table 1 Primers pairs used in LAMP for goat and bo ine

2.3 LAMP-HRM反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系的組成及濃度如下：1×Thermol Pol緩沖液、1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mol/L甜菜堿、4 mmol/L MgSO4、外引物F3和B3各0.2 μmol/L、內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μmol/L、8 U DNA聚合酶0.4 μL、20×E a Green熒光染料0.25 μL和DNA模板7 ng，總反應(yīng)體系為10 μL。將混合體系置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀中64 ℃反應(yīng)45 min，65～97 ℃進(jìn)行熔解分析。

根據(jù)上述LAMP反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過改變反應(yīng)溫度及引物比例對(duì)LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的反應(yīng)條件。LAMP擴(kuò)增所用的酶最適反應(yīng)溫度為60～68 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度降到60 ℃以下時(shí)，聚合酶的酶活力減弱，擴(kuò)增效率降低，因此選擇60、61、62、63、64和65 ℃ 6個(gè)溫度對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。改變奶牛和奶山羊的引物用量體積比例，即0.1∶0.2、0.15∶0.2、0.2∶0.2、0.1∶0.3、0.1∶0.4，以挑選出最適引物濃度比。

2.4 LAMP-HRM反應(yīng)特異性、靈敏度和牛羊乳不同混合比例檢測(cè)

按照LAMP體系配制反應(yīng)液，加入質(zhì)量濃度均為7 ng/μL的不同模板DNA，在最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，分析鑒定擴(kuò)增曲線及熔解曲線，以驗(yàn)證LAMP引物的特異性。

將牛乳和羊乳提取的DNA原液等比例混合，再進(jìn)行10倍質(zhì)量濃度梯度稀釋，即反應(yīng)體系中DNA質(zhì)量濃度分別為7、0.7、0.07、0.007和0.000 7 ng/μL，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度均取1.2 μL為反應(yīng)模板，進(jìn)行LAMP檢測(cè)。通過對(duì)熔解曲線的Tm值進(jìn)行分析來檢測(cè)方法的靈敏度。

取7 ng/μL的羊乳DNA為原液，分別摻入不同體積比例的牛乳DNA，體積比例依次為100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%和0%，取1.2 μL上述混合DNA作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，分析此方式的檢測(cè)限。在羊乳實(shí)際樣品中混合不同體積比例的牛乳，混合體積比例為100%、50%、15%、5%、1%、0.5%和0%，再進(jìn)行DNA提取，確定此種混合方式的檢測(cè)限。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)市售的8種乳制品進(jìn)行鑒定，通過對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析來評(píng)價(jià)LAMP-HRM方法的實(shí)際應(yīng)用能力，與已建立的實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證其方法的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)果與分析

3.1 LAMP-HRM方法可行性

a-傳統(tǒng)熔解峰; b-高分辨熔解峰1-牛;2-牛+羊;3-羊;4-NTC圖1 LAMP-HRM可行性的驗(yàn)證Fig.1 erification of LAMP-HRM feasibility注:動(dòng)物名稱代表各自DNA;NTC代表on template control,無DNA陰性性對(duì)照(下同)

3.2 LAMP-HRM反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.2.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化

為了消除由于溫度影響而產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增，選取牛羊DNA擴(kuò)增子熔解峰面積相近時(shí)的反應(yīng)溫度作為最佳擴(kuò)增溫度，此時(shí)2種擴(kuò)增子含量接近，擴(kuò)增效率相當(dāng)[21]。結(jié)果如圖2-a所示，在60～65 ℃溫度范圍內(nèi)，即使1 ℃的溫度變化，牛、羊源性DNA成分的熔解峰也有較大差距，說明溫度對(duì)雙重?cái)U(kuò)增影響較大。觀察到在63 ℃時(shí)，2種熔解峰面積接近，因此選擇63 ℃作為后續(xù)檢測(cè)的最佳反應(yīng)溫度。

a-反應(yīng)溫度優(yōu)化; b-引物濃度比優(yōu)化圖2 LAMP-HRM反應(yīng)體系的優(yōu)化Fig.2 Optimization of LAMP-HRM reaction system

3.2.2 引物濃度比優(yōu)化

在多重LAMP反應(yīng)中，由于不同靶標(biāo)的引物對(duì)之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系而產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增，容易導(dǎo)致其靶目標(biāo)序列擴(kuò)增效率的不同[22]。為了使擴(kuò)增效率一致，減少不同引物對(duì)之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，從而更清楚地區(qū)分2種DNA。如圖2-b所示，選擇引物濃度比為0.15∶0.2的一組，該比例條件下等溫?cái)U(kuò)增效率相對(duì)較高，更適合對(duì)乳制品中牛、羊源性成分同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 LAMP-HRM體系的特異性實(shí)驗(yàn)、靈敏度檢測(cè)和牛羊乳不同混合比例檢測(cè)

3.3.1 特異性檢測(cè)

利用建立的雙重LAMP-HRM方法對(duì)牛、羊及其他7種動(dòng)物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增并進(jìn)行熔解分析。由圖3-a可知，含有奶牛、奶山羊的反應(yīng)體系均有單峰出現(xiàn)，奶牛和奶山羊的混合物也出現(xiàn)雙峰，而其他動(dòng)物DNA模板均未出現(xiàn)熔解現(xiàn)象，表明建立的雙重LAMP-HRM方法具有較好的特異性，且設(shè)計(jì)的引物特異性也較好。

3.3.2 靈敏度檢測(cè)

將提取出的牛奶和羊乳線粒體 DNA混合物經(jīng)逐級(jí)稀釋后，如圖3-b結(jié)果所示，建立的LAMP-HRM方法能夠檢測(cè)到0.7 pg/μL的牛和羊DNA混合物，表明該方法具有較高的檢測(cè)靈敏度。

a-特異性; b-靈敏度圖3 LAMP-HRM反應(yīng)體系的特異性和靈敏度Fig.3 Specificity and sensiti ity for LAMP-HRM reaction system

3.3.3 牛羊乳不同混合比例檢測(cè)

將牛乳和羊乳DNA不同混合比例樣品按照最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP-HRM檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖4-a所示。當(dāng)摻入0.1%牛乳DNA時(shí)，該反應(yīng)體系內(nèi)仍可觀察到清晰的熔解信號(hào)。盡管1%的牛乳熔解峰值高于5%,但更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，牛羊乳峰高比值與相應(yīng)的混合比例呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。因此可以確定牛羊乳DNA混合的檢出限為0.1%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LAMP-HRM方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)能力，在羊乳實(shí)際樣品中混合不同比例的牛乳，再進(jìn)行DNA提取，結(jié)果如圖4-b，最低檢出限為0.5%，這可能是因?yàn)槿楸旧眢w系的復(fù)雜性和乳中細(xì)胞分布的不均勻性，混合乳之后再進(jìn)行DNA提取可能會(huì)造成提取不完全等。這2種方式混合比例的檢測(cè)均表明LAMP-HRM方法靈敏度較高。

a-牛羊乳DNA混合比例; b-牛羊乳實(shí)際樣品混合比例圖4 牛羊乳不同混合比例的LAMP-HRM檢測(cè)Fig.4 LAMP-HRM detection of different cow’s milk adulterated in goat’s milk注：圖a和b中插圖為各混合比例牛羊乳峰高比值相關(guān)性

3.4 市售樣品的應(yīng)用性檢測(cè)

牛源性成分為羊乳品中最為常見的摻假成分。采用上述建立的雙重LAMP-HRM方法對(duì)超市里銷售的全脂奶產(chǎn)品、低脂奶產(chǎn)品、嬰幼兒配方奶粉等8個(gè)商業(yè)產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)分析，并與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，2種方法的檢測(cè)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在分析的8種商業(yè)奶制品中，對(duì)于商品標(biāo)簽顯示含有100%的4個(gè)羊乳樣品，其中僅2個(gè)樣品(3、6)顯示與標(biāo)識(shí)符合，4、5號(hào)樣品則摻入了部分或全部的奶牛乳成分，與標(biāo)簽標(biāo)識(shí)不符；對(duì)于配方羊奶粉，國(guó)家允許添加牛乳清粉，樣品8、9、10均檢測(cè)出牛源性成分，與標(biāo)簽標(biāo)示相符。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)顯示，其檢測(cè)結(jié)果與LAMP-HRM反應(yīng)相比，結(jié)果完全一致，表明了LAMP-HRM檢測(cè)方法在實(shí)際樣品應(yīng)用中的高準(zhǔn)確性，可為大規(guī)模的牛羊乳樣品初篩提供一種技術(shù)支持。

表2 LAMP-HRM反應(yīng)體系對(duì)市售羊乳制品的應(yīng)用性檢測(cè)Table 2 Detection result of LAMP-HRM reaction system in goat milk products

4 結(jié)論

本研究將雙重LAMP擴(kuò)增技術(shù)與HRM技術(shù)相結(jié)合，針對(duì)奶牛、山羊分別設(shè)計(jì)了4條特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，利用不同靶標(biāo)的Tm值差異對(duì)2種目標(biāo)基因進(jìn)行同時(shí)區(qū)分，建立了羊乳中牛乳成分的雙重實(shí)時(shí)LAMP-HRM技術(shù)。結(jié)果表明，所建立的方法特異性好，當(dāng)體系中存在其中一種或兩種目標(biāo)物時(shí)都可將其檢出，且對(duì)其他物種沒有交叉反應(yīng)及假陽(yáng)性現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)牛羊混合DNA的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.7 pg/μL，并可用于不同市售樣品的檢測(cè)，適用于羊乳制品中摻入牛乳成分的快速檢測(cè)。與PCR-HRM技術(shù)相比，該方法不需要復(fù)雜的熱循環(huán)控溫儀器，而且不需要針對(duì)奶牛、奶山羊源性成分單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)、鑒別，在進(jìn)一步節(jié)省時(shí)間的同時(shí)也提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，適用于大規(guī)模樣品的初篩。值得注意的是，多重LAMP-HRM檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化，主要是在具有HRM檢測(cè)能力的實(shí)時(shí)PCR儀器上完成，近年來發(fā)展的便攜式恒溫LAMP檢測(cè)儀器已經(jīng)具備了很高的溫度分辨能力，也能夠滿足該方法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。