翟磊，葛媛媛，洪海軍，劉吉泉，李婷，沈穎，林雅芳，蔡俊松，劉驥，劉瑞娜，王旭，姚粟*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(聯(lián)合利華(中國(guó))有限公司，上海，200335) 3 (Procter & Gamble International Operations，新加坡，138547) 4(北京寶潔技術(shù)有限公司，北京，101312)5(查士利華微生物應(yīng)用技術(shù)(上海)有限公司，上海，201708)

近年來(lái)，我國(guó)化妝品質(zhì)量顯著提升，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015年至今我國(guó)化妝品市場(chǎng)抽檢合格率平均達(dá)到95%以上，但不合格產(chǎn)品中的微生物污染問(wèn)題仍然存在并被社會(huì)重點(diǎn)關(guān)注[1-4]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》[5](2015年版)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《規(guī)范》)將菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌納入常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，檢測(cè)方法為平板計(jì)數(shù)法，該方法檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)、使用人工計(jì)數(shù)，效率較低，目前已無(wú)法完全適應(yīng)化妝品行業(yè)產(chǎn)能擴(kuò)大、流通加速的迅猛發(fā)展需求[6]。當(dāng)前微生物快速檢驗(yàn)新興技術(shù)不斷涌現(xiàn)[7-10]，新方法開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證、適用性評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用成為微生物安全控制領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)并取得顯著進(jìn)展[11-14]。各國(guó)藥典和國(guó)際組織陸續(xù)頒布并不斷完善替代方法驗(yàn)證相關(guān)指南。借鑒國(guó)內(nèi)外食品和制藥等微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域的成功運(yùn)用經(jīng)驗(yàn)，對(duì)我國(guó)化妝品微生物檢驗(yàn)方法開(kāi)展系統(tǒng)性研究[15]，將有力推動(dòng)化妝品微生物檢測(cè)效率和過(guò)程控制水平提升，并在保障產(chǎn)品安全和消費(fèi)者權(quán)益方面發(fā)揮重要作用。

本課題組前期基于ATP生物熒光技術(shù)[16-19]建立了一套適用于微生物快速檢測(cè)的ATP生物熒光增幅法，具有檢測(cè)速度快，準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，可在48 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品中細(xì)菌、霉菌和酵母菌的定性檢驗(yàn)。該方法利用微生物體內(nèi)的腺苷酸激酶AK，催化添加的二磷酸腺苷ADP轉(zhuǎn)換為三磷酸腺苷ATP，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)ATP增幅；通過(guò)添加熒光素酶和熒光素，將ATP高能鍵在斷裂過(guò)程中產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為生物熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算生物熒光信號(hào)強(qiáng)度判斷樣品中是否含有微生物。為評(píng)價(jià)ATP生物熒光增幅法在化妝品微生物檢測(cè)中應(yīng)用的可行性，本研究收集了與化妝品原料及其生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47株代表性菌株，進(jìn)行了富集培養(yǎng)基MTAT的促生長(zhǎng)能力測(cè)試；選取了清潔類(lèi)、護(hù)理類(lèi)、美容修飾類(lèi)6種化妝品，通過(guò)樣品影響測(cè)試和接菌試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)化妝品產(chǎn)品的適用性，探究ATP生物熒光增幅法在化妝品及相關(guān)領(lǐng)域開(kāi)展微生物快速篩選與檢測(cè)的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)儀器

Celsis?Ad ance II 光度計(jì)，Charles Ri er Laboratories；恒溫振蕩搖床THZ-98AB，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；往復(fù)式搖床，EBERBACH；恒溫培養(yǎng)箱GHP-9270，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；生物安全柜AC2-4S1，ESCO。

1.2 試驗(yàn)菌株

通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)合微生物分類(lèi)學(xué)特征和生長(zhǎng)特性，本研究收集了與化妝品原料及其生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47種細(xì)菌、霉菌和酵母菌代表菌株，用于促生長(zhǎng)能力測(cè)試和產(chǎn)品適用性試驗(yàn)，具體菌株信息見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)樣品

根據(jù)化妝品分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[20]，選取了清潔類(lèi)、護(hù)理類(lèi)、美容修飾類(lèi)6種化妝品，包括洗發(fā)水、沐浴液、護(hù)發(fā)素、定型水、面霜和面膜，每種產(chǎn)品選取3個(gè)不同生產(chǎn)批次。

1.4 試驗(yàn)試劑

改良TAT(MTAT)培養(yǎng)基：TAT肉湯 22.50 g/L，硫代硫酸鈉 0.50 g/L、組氨酸 0.10 g/L、蛋白胨 7.50 g/L、葡萄糖 15.00 g/L、氯化鈉 0.85 g/L、卵磷脂1.43 g/L和吐溫80 39.00 g/L，pH 值調(diào)至7.0±0.1；ATP生物熒光增幅法試劑，Charles Ri er Laboratories Celsis?AMPiScreenTM；消泡劑，J.T.Baker?Antifoam B?Silicone Emulsion；0.5 mm玻璃珠，BioSpec Product。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 促生長(zhǎng)能力測(cè)試

將試驗(yàn)收集的細(xì)菌和酵母菌制備成10～100 CFU/10 mL的菌懸液，霉菌制備10～100 CFU/10 mL的孢子懸液，接種到90 mL富集培養(yǎng)基MTAT，置于(30±2) ℃搖床，200 r/min，振蕩培養(yǎng)24～48 h。在24或48 h取樣，使用ATP生物熒光增幅法對(duì)富集培養(yǎng)物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，若樣品為霉菌，則需使用玻璃珠破壁處理30 min后再上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)，將細(xì)菌富集培養(yǎng)物接種于卵磷脂吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于(36±1) ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)(48±2) h；酵母菌和霉菌富集培養(yǎng)物接種于虎紅培養(yǎng)基，置于(28±2) ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 d，確認(rèn)接種物是否有微生物生長(zhǎng)。

表1 促生長(zhǎng)能力測(cè)試結(jié)果Table 1 Growth promotion test results

促生長(zhǎng)能力測(cè)試通過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)為，試驗(yàn)收集的47株微生物菌株均能在富集培養(yǎng)基MTAT中生長(zhǎng)良好，且ATP生物熒光增幅法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。若促生長(zhǎng)能力測(cè)試不能通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)，需要對(duì)富集培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 產(chǎn)品適用性試驗(yàn)

產(chǎn)品適用性試驗(yàn)包括樣品影響測(cè)試和接菌試驗(yàn)。化妝品產(chǎn)品在應(yīng)用ATP生物熒光增幅法檢測(cè)前，應(yīng)先進(jìn)行產(chǎn)品適用性試驗(yàn)來(lái)確定ATP生物熒光增幅法是否適用于待檢產(chǎn)品。本研究選擇大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CICC 10389、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CICC 10419、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10384、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CICC 10275、白色念珠菌(Candidaalbicans)CICC 1965和黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2487用于產(chǎn)品適用性試驗(yàn)研究。

2.2.1 樣品影響測(cè)試

樣品影響測(cè)試的目的是確?；瘖y品中的配方成分不會(huì)影響ATP生物熒光增幅法檢測(cè)，每種產(chǎn)品檢測(cè)3個(gè)不同生產(chǎn)批次。操作步驟為：將10～100 CFU試驗(yàn)菌株接種于10 mL富集培養(yǎng)基MTAT中制備菌懸液 (黑曲霉制備孢子懸液)，同時(shí)將等量的菌液涂布于卵磷脂吐溫-80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上確認(rèn)實(shí)際接種量。稱(chēng)取10 g產(chǎn)品，加至90 mL富集培養(yǎng)基MTAT中，充分振蕩混勻，取10 mL 1∶10稀釋液加到90 mL富集培養(yǎng)基MTAT制備成產(chǎn)品樣品，同時(shí)將不接菌的富集培養(yǎng)基MTAT作為培養(yǎng)基空白。將上述制備的菌懸液、產(chǎn)品樣品和培養(yǎng)基空白置于(30±2) ℃搖床，200 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h。取樣，對(duì)富集培養(yǎng)后的產(chǎn)品樣品進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，并使用平板培養(yǎng)方法確認(rèn)產(chǎn)品中是否含有微生物；取900 μL培養(yǎng)基加入100 μL ATP標(biāo)品，制備成ATP對(duì)照；取900 μL培養(yǎng)基空白加入100 μL富集培養(yǎng)物的100倍稀釋液，制備成微生物對(duì)照；取900 μL產(chǎn)品樣品加入100 μL ATP陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)品，制備為ATP樣品；取900 μL產(chǎn)品樣品加入100 μL富集培養(yǎng)物的100倍稀釋液，制備成微生物樣品。將上述制備的樣品和對(duì)照進(jìn)行ATP生物熒光增幅法檢測(cè)，同時(shí)取100 μL涂布于卵磷脂吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上確認(rèn)相應(yīng)樣品中是否含有微生物。樣品影響測(cè)試結(jié)果的通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 樣品影響測(cè)試通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Success criteria for sample effect tests

2.2.2 接菌試驗(yàn)

接菌試驗(yàn)主要用于確認(rèn)加入樣品中的防腐劑能否被富集培養(yǎng)基有效中和，每種產(chǎn)品檢測(cè)3個(gè)不同生產(chǎn)批次。操作步驟為：稱(chēng)取10 g產(chǎn)品，加入90 mL富集培養(yǎng)基MTAT，充分振蕩混勻，取10 mL 1∶10稀釋液加到90 mL富集培養(yǎng)基MTAT制備成產(chǎn)品樣品，同時(shí)將不接菌的富集培養(yǎng)基MTAT作為培養(yǎng)基空白。將試驗(yàn)菌株制備成10～100 CFU/100 μL的菌懸液(黑曲霉制備孢子懸液)備用，同時(shí)取100 μL涂布于卵磷脂吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上以確認(rèn)實(shí)際接種量。接種100 μL菌懸液或孢子懸液于產(chǎn)品樣品中制備成微生物樣品，同時(shí)接種100 μL菌懸液或孢子懸液于培養(yǎng)基空白中制備成微生物對(duì)照；將制備的產(chǎn)品樣品、培養(yǎng)基空白、微生物樣品和微生物對(duì)照置于(30±2) ℃搖床，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。對(duì)富集培養(yǎng)后的樣品進(jìn)行ATP生物熒光增幅法檢測(cè)，若樣品為霉菌，則需使用玻璃珠破壁處理30 min后再上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)取100 μL富集液涂布于卵磷脂吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上確認(rèn)樣品中是否含有微生物。接菌試驗(yàn)通過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)為，微生物樣品和微生物對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，未接菌的產(chǎn)品樣品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 促生長(zhǎng)能力測(cè)試

促生長(zhǎng)能力測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。本研究收集的47株微生物菌株在富集培養(yǎng)基MTAT中生長(zhǎng)良好，ATP生物熒光增幅檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，并且在卵磷脂吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，表明富集培養(yǎng)基MTAT的促生長(zhǎng)能力測(cè)試符合要求。

促生長(zhǎng)能力測(cè)試主要考察MTAT培養(yǎng)基對(duì)菌株的富集培養(yǎng)能力，試驗(yàn)菌株的選擇尤為關(guān)鍵。本研究結(jié)合微生物分類(lèi)學(xué)特征和生長(zhǎng)特性，選取與化妝品原料與生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47種細(xì)菌、酵母和霉菌代表菌株，用于考察MTAT培養(yǎng)基的富集能力。從微生物分類(lèi)特征上看，選取的菌株包括28株細(xì)菌(15株革蘭氏陰性細(xì)菌和13株革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)，5株酵母菌和14株霉菌，具有良好的代表性。從生理特性上看，既有生長(zhǎng)速度快的代表菌株，又有對(duì)營(yíng)養(yǎng)苛求、生長(zhǎng)較為緩慢的代表菌種，如聚多曲霉(Aspergillussydowii)CICC 40930，繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)CICC 40279，宛氏擬青霉(Paecilomycesariotii)CICC 4025，拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailli)CICC 1281和樹(shù)脂枝孢霉(Cladosporiumresinae)CICC 41706，在富集培養(yǎng)基MTAT中培養(yǎng)48 h后，ATP生物熒光增幅檢測(cè)結(jié)果才為陽(yáng)性。這5株真菌是生長(zhǎng)緩慢的菌株的代表，為今后研究中生長(zhǎng)緩慢代表菌株的選擇提供了重要的依據(jù)。

3.2 產(chǎn)品適用性試驗(yàn)

3.2.1 樣品影響測(cè)試

樣品影響測(cè)試主要測(cè)試化妝品產(chǎn)品的本底信號(hào)值，確?；瘖y品配方成分不會(huì)影響ATP生物熒光增幅法的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，培養(yǎng)基空白的信號(hào)值在167～285 RLU，遠(yuǎn)低于檢測(cè)方法規(guī)定的 1 000 RLU，表明富集培養(yǎng)基MTAT本底信號(hào)符合要求。產(chǎn)品樣品的信號(hào)值在87～199 RLU，也遠(yuǎn)低于3倍培養(yǎng)基空白信號(hào)值的要求，并且通過(guò)涂布平板確認(rèn)化妝品樣品中未見(jiàn)微生物污染。此外，ATP對(duì)照、微生物對(duì)照、ATP樣品和微生物樣品的信號(hào)值均大于3 倍培養(yǎng)基空白的信號(hào)值，并且測(cè)試產(chǎn)品中ATP回收率在73.8%～106.8%，高于25%的標(biāo)準(zhǔn)推薦值，表明本研究選取的6種產(chǎn)品均通過(guò)樣品影響測(cè)試。

3.2.2 接菌試驗(yàn)

接菌試驗(yàn)主要是證明化妝品中的抑菌作用能否被富集培養(yǎng)基有效中和，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。培養(yǎng)基空白的信號(hào)值在145～178 RLU，遠(yuǎn)低于檢測(cè)方法規(guī)定的1 000 RLU，產(chǎn)品樣品的信號(hào)值在86～198 RLU，檢測(cè)結(jié)果為陰性，并且涂布平板確認(rèn)化妝品樣品中未見(jiàn)微生物污染。而接種試驗(yàn)菌懸液的微生物對(duì)照和微生物樣品，ATP生物熒光增幅法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，并且通過(guò)平板確認(rèn)微生物對(duì)照和微生物樣品中微生物生長(zhǎng)良好，表明本研究選取的6種產(chǎn)品均通過(guò)接菌試驗(yàn)。

綜合樣品影響測(cè)試和接菌試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，ATP生物熒光增幅法適用于本研究所選洗發(fā)水、沐浴液、護(hù)發(fā)素、定型水、面霜和面膜中微生物的快速篩選與檢測(cè)，為后續(xù)該方法進(jìn)行方法驗(yàn)證和方法適用性研究奠定了基礎(chǔ)。

表3 樣品影響測(cè)試結(jié)果Table 3 Sample effect test results

表4 接菌試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Spiking test results

4 結(jié)論

本研究收集的與化妝品原料及其生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47株代表性菌株，在富集培養(yǎng)基MTAT中生長(zhǎng)良好，均通過(guò)了促生長(zhǎng)能力測(cè)試；選取的清潔類(lèi)、護(hù)理類(lèi)、美容修飾類(lèi)中6種化妝品均符合樣品影響測(cè)試和接菌試驗(yàn)檢測(cè)方法的要求。因此，ATP生物熒光增幅法具有在化妝品及相關(guān)領(lǐng)域開(kāi)展微生物快速篩選與檢測(cè)的良好應(yīng)用前景。