肖婷，何欣遙，吳姍鴻，代慧，段志蓉，張敏*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400715) 3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(重慶)，重慶，400715)

小白菜莖葉可食，青翠嫩綠、鮮美爽口，富含維生素和礦物質(zhì)[1]。此外，小白菜以其通腸利胃、抗癌排毒、潤膚抗老的功效深受消費者青睞，素有“菜中之王”的美譽。但小白菜作為一種綠葉蔬菜，采后極易褪綠黃化，常溫下僅能維持鮮綠狀態(tài)1～2 d[2]，嚴(yán)重影響消費者的購買和食用欲望，也極大增加了商家損耗。

目前小白菜的護色保鮮技術(shù)主要有植物精油處理[3]、氣調(diào)儲藏[4]和1-甲基環(huán)丙烯處理[5]，然而受成本、實用性、安全性及可操作性等因素影響，這些技術(shù)的應(yīng)用具有一定局限性。乙醇已在食品行業(yè)中普遍使用，其安全性被美國食品和藥物管理局認(rèn)可，乙醇熏蒸處理的優(yōu)勢是安全、經(jīng)濟、操作簡便和處理時間短[6-7]，該技術(shù)已被成功應(yīng)用于園藝產(chǎn)品如西蘭花[8]、荷蘭豆[9]、紅薯尖[10]等的護綠保鮮。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),50 μL/L乙醇熏蒸處理可誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性，通過提升抗氧化酶活性來保持紅薯尖的良好感官和較高的葉綠素含量[10]。陶煒煜[11]發(fā)現(xiàn)6 mL/kg乙醇處理可以提高鮮切西蘭花過氧化物酶(peroxidase，POD)、CAT和SOD活性，提高酶促系統(tǒng)的抗氧化能力，從而抑制西蘭花的呼吸強度和乙烯釋放，達(dá)到較好的保綠效果。李丹等[12]用0.25、0.5和1 mL/L的乙醇處理西蘭花，發(fā)現(xiàn)乙醇處理通過延緩黃酮含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力的下降來維持機體的抗氧化能力，從而維持西蘭花的品質(zhì)。宋鹵哲等[6]發(fā)現(xiàn)500 μL/L乙醇熏蒸可提升抗氧化酶CAT活性和抗氧化物質(zhì)總酚、類黃酮的含量，從而降低獼猴桃葉綠素分解速率。不少研究表明，葉綠素降解與活性氧代謝相關(guān)，活性氧清除能力過低會使得活性氧蓄積，從而加速細(xì)胞膜脂過氧化，引發(fā)膜損傷，加速葉綠素的降解[13-15]。前人研究乙醇護綠機理多集中于抗氧化水平方面，對綠葉蔬菜活性氧產(chǎn)生能力、清除能力與膜損傷對黃化褪綠的影響的研究未形成體系。而且，乙醇熏蒸是否對小白菜有護綠作用尚不明確。本文以小白菜為實驗對象，對其進行不同濃度乙醇處理，探究乙醇對采后小白菜體內(nèi)活性氧、活性氧清除系統(tǒng)、膜系統(tǒng)及小白菜色澤的影響，從活性氧方面系統(tǒng)的闡述乙醇護綠機理，考察不同濃度乙醇對小白菜護綠效果的差異，確定合適的乙醇劑量，為解決小白菜采后易黃化褪綠的問題提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮小白菜購于重慶市北碚菜市場，品種為重慶小水白，于2020年1月4日上午5點左右采摘，7點前運送至實驗室。揀選標(biāo)準(zhǔn)：葉片和莖部完整，葉片直挺、嫩綠、有光澤，無枯黃葉、腐爛葉。

聚乙烯袋，30 cm×40 cm，厚度30 μm，石家莊誠勝塑業(yè)；泡沫箱，外尺寸40 cm×30.5 cm×20 cm，壁厚2.4 cm，成都國亨泡沫制品；95%乙醇(分析純)，成都市科龍試劑廠；紗布，重慶北碚實驗用品超市。

1.2 儀器與設(shè)備

RXZ-800B型智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；U -2450PC型紫外可見分光光度計，日本島津公司；UltraScan?PRO型測色儀，美國HunterLab公司；DDS-307A型電導(dǎo)率儀，上海雷磁公司；H1650R型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀公司。

1.3 實驗方法

前期實驗表明每個泡沫箱內(nèi)裝350 g小白菜為宜。實驗共設(shè)4組，熏蒸濃度分別為0(CK)、500、750、1 000 μL/L(乙醇溶液體積/泡沫箱體積)。將揀選好的小白菜放入泡沫箱，將疊放的4層紗布粘在箱蓋內(nèi)部中央，分別取一定體積的乙醇(體積分?jǐn)?shù)95%)均勻地滴在紗布上，迅速封箱，于25 ℃室溫熏蒸3 h。開箱后置于通風(fēng)處30 min，再將小白菜裝入聚乙烯袋，每袋(100±5) g，每組3個平行，在袋上貼好標(biāo)簽后封口。包裝好的小白菜放入氣候箱，20 ℃左右、相對濕度55%～65%條件下貯藏6 d，未對燈光進行設(shè)置，直接參考日光，每天測定指標(biāo)。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 色差L*、a*、b*值

參考王羽等[16]的方法，用測色儀測定小白菜的L*、a*、b*值。L*反映明度，a*值反映紅綠偏向，b*反映黃藍(lán)偏向。每個平行隨機取3棵小白菜，每棵小白菜取最外葉測定5個點，分別為主葉脈頂部1點，兩側(cè)區(qū)域各2點，最后結(jié)果取平均值。

1.4.2 葉綠素含量

參照徐芬芬等[17]的方法，用乙醇丙酮[(乙醇)∶(丙醇)=1∶1]浸提法測定，葉綠素含量按公式(1)計算：

葉綠素含量/(mg·g-1)=20.29×A645+8.05×A663

(1)

式中：A645、A663分別為645、663 nm波長處的吸光度。

1.4.3 相對電導(dǎo)率

參照程曦等[18]的方法進行測定，以%表示。

1.4.4 丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量

采用硫代巴比妥酸法，參考肖婷等[10]的方法，單位為μmol/g。

1.4.5 抗壞血酸(ascorbic acid,ASA)含量

采用碘酸鉀滴定法[19]測定，單位為mg/100 g。

1.4.6 POD、CAT、SOD、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性測定

采用分光光度計法[20-22]測定，單位為U/g。

1.4.7 還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量

參照QIAN等[23]的方法用分光光度計測定，GSH和二硫代硝基苯甲酸反應(yīng)生成的2-硝基-5-巰基苯甲酸在波長412 nm處具有最大光吸收。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為n(GSH)=80.837 9×A412+1.990 7，R2=0.998 6。根據(jù)樣品管反應(yīng)混合液與空白對照管顯色液吸光度值的差值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的GSH物質(zhì)的量(n)，每克小白菜葉片中的GSH物質(zhì)的量即為GSH含量，單位為μmol/g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)；SPSS 22統(tǒng)計分析；顯著性分析采用最低顯著性差異法，P>0.05表示差異性不顯著，0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD活性

圖1 乙醇熏蒸對小白菜SOD活性的影響Fig.1 Effects of ethanol fumigation on SOD acti ity of pakchoi

2.2 CAT活性

圖2 乙醇熏蒸對小白菜CAT活性的影響Fig.2 Effects of ethanol fumigation on CAT acti ity of pakchoi

2.3 APX活性

圖3 乙醇熏蒸對小白菜APX活性的影響Fig.3 Effects of ethanol fumigation on APX acti ity of pakchoi

2.4 POD活性

POD、CAT和APX都是清除H2O2的酶[31]。如圖4所示，0～4 d，POD活性不斷攀升，這可能是因為貯藏前期CAT活性上升緩慢(圖2)且APX活性一直降低(圖3)，兩者清除底物H2O2的能力有限，故機體需增強POD活性來清除H2O2。貯藏4～5 d，POD活性迅速下降，這一現(xiàn)象與CAT活性的變化相似，推測機體內(nèi)出現(xiàn)了反饋抑制[32]。5～6 d，POD活性回升，也許是機體內(nèi)啟動了ASA-GSH循環(huán)，減輕了POD清除H2O2的負(fù)擔(dān)[19]。500、750 μL/L組誘導(dǎo)POD活性全程高于其他2組。750 μL/L組在第3、4、6天與CK組差異極顯著(P<0.01)；500 μL/L組在第3、4天與CK組差異顯著(P<0.05)，第6天差異極顯著(P<0.01)；1 000 μL/L組全程與CK組未形成顯著性差異(P>0.05)，且第2天時POD活性低于CK組?？梢姡?00和750 μL/L組均能有效誘導(dǎo)POD活性的提高，750 μL/L組提升程度更高。

圖4 乙醇熏蒸對小白菜POD活性的影響Fig.4 Effects of ethanol fumigation on POD acti ity of pakchoi

2.5 ASA含量

圖5 乙醇熏蒸對小白菜ASA含量的影響Fig.5 Effects of ethanol fumigation on ASA content of pakchoi

2.6 GSH含量

GSH是細(xì)胞體內(nèi)關(guān)鍵的非酶性抗氧化物質(zhì)，能參與緩沖機體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，對抗活性氧對機體的傷害[36]。如圖6所示，GSH含量呈波動下降趨勢。0～1 d和4～5 d各組GSH含量上升，推測是此段貯藏期間外部環(huán)境不利于小白菜貯藏，小白菜由此作出應(yīng)激反應(yīng)[37]。1～4 d各組呈下降趨勢，結(jié)合ASA含量的變化趨勢(圖5)，推測此階段GSH以自身氧化為代價促進ASA的還原再生[19]。750 μL/L組在第1天時GSH含量顯著高于CK組(P<0.05)，第2、3天極顯著高于其他3組(P<0.01)，750 μL/L組在維持較高的GSH含量上效果最佳。

圖6 乙醇熏蒸對小白菜GSH含量的影響Fig.6 Effects of ethanol fumigation on GSH content of pakchoi

圖7 乙醇熏蒸對小白菜產(chǎn)生速率的影響Fig.7 Effects of ethanol fumigation on superoxide anion radical production rate of pakchoi

2.8 MDA含量

圖8 乙醇熏蒸對小白菜MDA含量的影響Fig.8 Effects of ethanol fumigation on MDA content of pakchoi

2.9 相對電導(dǎo)率

相對電導(dǎo)率表征細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞程度[18]，儲存期間，細(xì)胞逐漸衰老，膜通透性逐漸增大。1 000 μL/L組相對電導(dǎo)率在貯藏初期上升幅度最大，在第1、3天顯著高于CK組(P<0.05)，第2、6天極顯著高于CK組(P<0.01)，可能是乙醇濃度過高加速了膜破裂[40]，加劇離子泄露。第2天開始，CK組增長幅度大幅增加，3～4 d時其相對電導(dǎo)率值僅稍低于1 000 μL/L組，第5天時已經(jīng)高于1000 μL/L組。0～2 d，750 μL/L組與CK組、500 μL/L組未形成顯著性差異(P>0.05)；3～6 d，750 μL/L組相對電導(dǎo)率極顯著低于CK組和500 μL/L組(P<0.01)。這可能是因為750 μL/L組能夠最有效地抑制膜脂過氧化，從而減弱細(xì)胞膜的破壞程度。

圖9 乙醇熏蒸對小白菜相對電導(dǎo)率的影響Fig.9 Effects of ethanol fumigation on relati e conducti ity of pakchoi

2.10 葉綠素含量

如圖10所示，隨著儲存時間的延長，小白菜逐漸衰老，體內(nèi)的葉綠素逐漸降解，各組葉綠素含量逐漸減少。500和750 μL/L組下降趨勢較平緩，CK組和1 000 μL/L組下降較迅速。1～3 d，CK組尚未與500、750 μL/L組形成顯著性差異(P<0.05)；4～6 d，CK組葉綠素含量極顯著低于500和750 μL/L組(P<0.01)。1 000 μL/L組葉綠素含量始終為最低值，且0～2 d與CK組差異顯著(P<0.05)，4～6 d差異極顯著(P<0.01)。到貯藏結(jié)束時，750 μL/L組葉綠素含量為29.54 mg/g，分別為其他3組的288.48%(CK組)、144.59%(500 μL/L組)和556.31%(1 000 μL/L組)，差異極顯著(P<0.01)。適宜濃度乙醇熏蒸條件下，小白菜細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定性的有效維持使得位于不同空間的葉綠素降解酶和葉綠素難以接觸[15]，葉綠素降解難度增加，小白菜保持更高的葉綠素含量；而高劑量乙醇加劇膜損傷，促進葉綠素降解。

圖10 乙醇熏蒸對小白菜葉綠素含量的影響Fig.10 Effects of ethanol fumigation on chlorophyll content of pakchoi

2.11 色差L*、a*、b*值

如圖11所示，貯藏期間小白菜L*、a*、b*值均呈現(xiàn)上升趨勢。L*值反映明度，L*值呈現(xiàn)上升趨勢表示小白菜在貯藏過程中逐漸變亮，500和750 μL/L組的L*值上升趨勢較緩慢。a*值反映色澤的紅綠偏向，a*為負(fù)值表示顏色偏向為綠色，負(fù)值越小，小白菜越鮮綠，a*值越接近零，小白菜色澤越偏離綠色。貯藏前期各組a*值差異尚不顯著(P>0.05)。第2天起，1 000 μL/L組a*值迅猛增加，貯藏中期顯著(P<0.05)高于其他3組，第4天時a*值已達(dá)-2.9。500和750 μL/L組整個貯藏期間a*值變化較小，750 μL/L組在貯藏前期、中期更能維持較低a*值，貯藏后期500 μL/L組更能延緩小白菜褪綠速率。貯藏結(jié)束時，500 μL/L組a*值為-6.40，750 μL/L組為-5.41，顯著低于CK組和1 000 μL/L組(P<0.05)。b*值反映小白菜的黃藍(lán)偏向，b*值為正值說明顏色偏向為黃色，正值越大小白菜越黃。圖11-c顯示CK組和1 000 μL/L組的b*值增長迅速，第2天后與其他2組形成顯著差異(P<0.05)，說明這2組小白菜變黃速率快，乙醇濃度較低的2組可以抑制b*值的上升，延緩小白菜黃化速率。綜上，500和750 μL/L組可很好的抑制L*、a*、b*值的上升，更好的延緩小白菜黃化褪綠速率。

a-L*值; b-a*值; c-b*值圖11 乙醇熏蒸對小白菜色差值的影響Fig.11 Effects of ethanol fumigation on color indexes of pakchoi

3 討論與結(jié)論

并非所有的乙醇熏蒸濃度均對小白菜有護綠效果，本研究中，1 000 μL/L乙醇熏蒸處理由于濃度過高，對小白菜的破壞能力超出其自身修復(fù)能力，不利于小白菜的采后護綠。1 000 μL/L乙醇不利于貯藏中期SOD、CAT活性和GSH含量的維持，貯藏后期ASA含量下降趨勢快于對照組，活性氧代謝平衡被打破，難以維持較低的MDA含量和相對電導(dǎo)率，引發(fā)了膜損傷，最終加速了葉綠素的降解，難以保持鮮綠狀態(tài)。