彭志杰,杜嬌,張羽婷,郭東東,雷佳鈺,耿雪冉,2,孟俊龍,2,常明昌,2*

1(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中，030801)2(山西省食用菌工程技術(shù)研究中心，山西 晉中，030801)

灰樹花(Grifolafrondosa)，俗稱蓮花蘑、栗子蘑等[1-2]，屬于真菌界、擔(dān)子菌門、擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、多孔菌屬[3]，在日本稱之為“舞茸”，屬于珍貴的食藥兩用真菌[4]。

研究表明，灰樹花具有抗病毒、抗生素、抗炎癥、降血糖、降膽固醇和降血壓的功效[5]，這得益于其中含有的多種活性物質(zhì)，如活性多糖、核酸、多酚和氨基酸等，同時還是一種抗癌藥源[6]，因此受到很多消費者的青睞。近年來，國內(nèi)外對灰樹花多糖的研究較多，主要表現(xiàn)在多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)表征及生物活性等方面[5,7-8]，而對灰樹花蛋白的研究相對較少，主要集中在提取[9-11]和酶解[12]方面，關(guān)于灰樹花蛋白的理化性質(zhì)及功能特性的研究，國內(nèi)外鮮有報道。

本研究以灰樹花子實體為原料，利用3種方法提取灰樹花蛋白，并對蛋白的理化性質(zhì)、功能特性進行研究，為灰樹花及其粗蛋白在食品加工和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花，浙江慶元縣食用農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)部；

牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250，北京索萊寶生物科技有限公司；大豆油，山西太谷縣農(nóng)貿(mào)市場；NaOH、(NH4)2SO4、石油醚、無水乙醇、丙酮、鹽酸、NaH2PO4、Na2HPO4,均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱(DF205)，北京醫(yī)療設(shè)備廠；萬能高速粉碎機(YB-2500A)，永康市蘇豐工貿(mào)有限公司；恒溫振蕩水浴鍋(HHS-21-6)，上海博訊實業(yè)有限公司；磁力攪拌器(DF-101S)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；高速冷凍臺式離心機(Multifuge X1R)，貝克曼庫爾特(美國)股份有限公司；真空冷凍干燥機(Alpha 2-4 LS Cbasic)，德國CHRIST公司；pH計(Orion Star A)，賽默飛世爾科技有限公司；馬弗爐(KSJ)，上海電機(集團)公司；高速剪切乳化分散機(FA25)，上海弗魯克流體機械制造有限公司；石墨消解儀(SH220 N)、自動凱氏定氮儀(K9840)，山東海能科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(U -1800PC)，上海美譜達儀器有限公司；電感耦合等離子體光譜儀(Optima 5300 D )，美國珀金埃爾默儀器有限公司；掃描電鏡(JEOL JEM-6490L )，日本電子儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 灰樹花子實體預(yù)處理

將灰樹花子實體放入50 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干，之后進行粉粹，將粉碎后的子實體粉末過篩。灰樹花粉末和石油醚按照1∶5(g∶mL)的比例進行混合，放到通風(fēng)櫥中攪拌0.5 h，然后再靜置3 h，將上層石油醚回收，剩余部分放置在通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干，待完全干燥后收集粉末，即得到脫脂灰樹花粉末。

1.3.2 灰樹花基本成分測定

蛋白質(zhì)測定：參照GB 5009.5—2016 《食品中蛋白質(zhì)的測定》；水分測定：參照GB 5009.3—2016 《食品中水分的測定》；灰分測定：參照GB 5009.4—2016 《食品中灰分的測定》。

1.3.3 灰樹花蛋白的制備

1.3.3.1 堿溶酸沉法

根據(jù)陳雪洋等[13]的方法，略作修改。將脫脂灰樹花粉末與蒸餾水按照1∶40(g∶mL)混合，用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至13.0，之后將混合液在40 ℃恒溫條件下浸提3 h；6 500 r/min離心15 min，收集上清液；用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH至3.5，并且靜置30 min，6 500 r/min離心15 min，棄去上清液；將沉淀用蒸餾水洗3次，再用0.05 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，冷凍干燥得到粗蛋白。

1.3.3.2 鹽析法

取適量脫脂灰樹花粉末用蒸餾水溶解，料液比為1∶44(g∶mL)，混合后放入水浴鍋中，51 ℃浸提36 min；浸提完成后6 500 r/min離心20 min，收集上清液；按照(NH4)2SO4沉淀表，加入(NH4)2SO4至飽和度為80%，在4 ℃下靜置24 h，6 500 r/min離心20 min，去除上清液，然后將沉淀物溶于適量蒸餾水中透析24 h，冷凍干燥得到粗蛋白。

1.3.3.3 丙酮沉淀法

參照任雨賀等[14]的方法，稍加改動。稱取適量脫脂灰樹花粉末，加入10倍體積的10 mmol/L 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.2)攪拌均勻；將混合物4 ℃浸提120 min。于4 ℃下，6 500 r/min離心20 min，取其上清液于4 ℃保存。再向沉淀中加入等體積的10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.2)，進行2次浸提。于4 ℃下，6 500 r/min離心20 min，取上清液，將其與第1次上清液合并。向上述的蛋白粗提液中加入2.0倍體積丙酮，-20 ℃下靜置12 h，6 500 r/min離心30 min，棄去上層液體，下層固形物置于-20 ℃揮干丙酮，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃過夜并凍干，蛋白質(zhì)干粉于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 灰樹花蛋白的純度測定

精確稱取適量蛋白樣品并記錄質(zhì)量，移入干燥的定氮瓶中，按照GB 5009.5—2016 《食品中蛋白質(zhì)的測定》進行實驗，并利用自動凱氏定氮儀測定并計算蛋白純度。

1.3.5 灰樹花蛋白氨基酸組成的測定[15]

精確稱取適量樣品，記錄質(zhì)量并放置在備好的安瓿瓶中，按照GB 5009.124—2016 《食品中氨基酸的測定》測定氨基酸種類和含量。

1.3.6 微量元素檢測分析

稱取適量樣品并記錄質(zhì)量，放入坩堝中，之后放到馬弗爐中在500～600 ℃灼燒；待灼燒完成后自然冷卻至室溫，向坩堝中加入適量的體積分數(shù)25% HCl溶液，使坩堝內(nèi)的混合物充分溶解，并定容至25 mL；取適量樣液，利用電感耦合等離子體光譜儀進行測定分析。

1.3.7 掃描電鏡分析

將灰樹花蛋白用雙面膠粘在樣品座上，將樣品座置于離子濺射儀，在樣品表面蒸鍍1層10～20 nm厚的鉑金膜，調(diào)節(jié)電鏡至最佳拍攝視野，并放大至合適倍數(shù)，觀察并拍攝相應(yīng)的樣品照片。

1.3.8 溶解性的測定[16]

用去離子水配制10 mL 10 g/L的蛋白溶液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0，室溫振蕩10 min，4 000 r/min離心20 min，收集上清液采并用Bradford法測定蛋白含量，根據(jù)公式(1)計算蛋白溶解性：

(1)

1.3.9 持水性的測定[16]

準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白樣品，記為m，稱取空離心管質(zhì)量，記為m1，將蛋白樣品放入離心管中，并加入10.0 mL去離子水?；靹蚝箪o置30 min，5 000 r/min離心 20 min，離心結(jié)束后，除去上層清液，稱量此時離心管的質(zhì)量，記為m2。根據(jù)公式(2)計算蛋白的持水性：

(2)

1.3.10 持油性的測定[16]

準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白樣品，記為m，稱取空離心管質(zhì)量，記為m1，將蛋白樣品放入離心管中，并加入10.0 mL大豆油。混勻后靜置30 min，5 000 r/min離心20 min，離心結(jié)束后，除去上層大豆油，稱量此時離心管的質(zhì)量，記為m2。根據(jù)公式(3)計算蛋白的持油性：

(3)

1.3.11 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定[16-17]

用去離子水配制10 g/L的蛋白溶液，量取15 mL蛋白溶液于100 mL的離心管中，體積記為0。利用均質(zhì)機在10 000 r/min條件下均質(zhì)2 min，室溫下測定總體積1，靜置30 min后再次測定總體積2。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別利用公式(4)和(5)進行計算：

(4)

(5)

1.3.12 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定[18-19]

用去離子水配制50 g/L的蛋白溶液，從中量取20 mL的蛋白溶液于100 mL離心管中，40 ℃水浴振蕩反應(yīng)20 min，之后向離心管中再加入20 mL大豆油混合，利用均質(zhì)機在10 000 r/min條件下均質(zhì)3 min；讀取并記錄乳濁液體積，0；乳化層體積，1；然后將乳濁液放入80 ℃水浴鍋中水浴30 min，待反應(yīng)完成后冷卻至室溫，2 000 r/min離心5 min，讀取并記錄剩余乳化層體積2。根據(jù)公式(6)和(7)分別計算乳化性和乳化穩(wěn)定性：

(6)

(7)

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進行3次，利用Excel軟件進行統(tǒng)計和分析、SPSS 25軟件進行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花的基本組成成分

經(jīng)過測定，灰樹花的基本組成成分為水分11.37%、灰分6.94%、蛋白質(zhì)含量19.91%。其中蛋白含量高于杏鮑菇(17.57%)[15]、云耳(10.30%)、銀耳(9.60%)和巖耳(9.00%)[16]。因此可以認為灰樹花是一種高蛋白含量的營養(yǎng)食品，能夠作為潛在的蛋白來源。

2.2 灰樹花蛋白的純度

堿溶酸沉法，即等電點沉淀，是利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，通過調(diào)節(jié)溶液pH，使蛋白沉淀析出。鹽析沉淀法是利用蛋白質(zhì)在不同鹽濃度條件下溶解度不同特性，通過向提取液中添加一定濃度的中性鹽，使蛋白從溶液中沉淀析出。有機溶劑沉淀法是利用蛋白質(zhì)與其他雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的有機溶劑，使蛋白沉淀析出[20]。因此本試驗利用這3種方法提取蛋白，并對其進行分析研究，以確定灰樹花蛋白提取的最適方法。

經(jīng)凱氏定氮測得3種方法提取得到的蛋白純度如表1所示，堿溶酸沉法得到的蛋白純度最高，達到45.35%，這是因為堿性溶液更有利于蛋白溶出，所以提取的純度更高；鹽析法次之，為35.87%；丙酮沉淀法得到的蛋白純度僅有7.11%，推測原因可能是利用丙酮沉淀蛋白時不完全，并未將全部蛋白沉淀下來。以上結(jié)果初步說明，堿溶酸沉法是一種方便快捷并且效率較好的方法，可以廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的提取。

表1 三種灰樹花蛋白的純度Table 1 Purity of Grifola frondosa protein extracted by three methods

2.3 灰樹花蛋白的氨基酸組成

3種方法提取出的灰樹花蛋白的氨基酸組成見表2，由于本實驗采用酸水解法，在此過程中色氨酸被破壞，無法檢測。3種方式提取的灰樹花蛋白氨基酸種類豐富，共檢測出17種氨基酸(丙酮沉淀法為16種，可能是因為蛋白的提取率過低，導(dǎo)致種類和含量較少)，這與杏鮑菇[15]、羊肚菌[21]的檢測結(jié)果基本相近。由表2可知,3種提取方法中谷氨酸含量最高，分別占總氨基酸含量的13.71%、13.83%和14.56%，其次是天冬氨酸。這主要是因為谷氨酸和天冬氨酸均為酸性氨基酸，是食品中重要的鮮味物質(zhì)，因此使得灰樹花具有獨特的味道[15,22-23]。3種蛋白的氨基酸組成之間存在較大差異，氨基酸含量各不相同，但是各種氨基酸所占比例大致相同，推測這可能與3種蛋白的純度有關(guān)，純度表示為蛋白的有效成分。由表1和表2綜合分析可知，蛋白純度越高，相應(yīng)的氨基酸含量越多。試驗結(jié)果間接表明3種蛋白提取方法的有效性，為不同目的性的蛋白提取提供一定依據(jù)。

堿溶酸沉法、鹽析法與丙酮沉淀法的第一限制氨基酸均為苯丙氨酸，賴氨酸是堿溶酸沉法與鹽析法的第二限制氨基酸，丙酮沉淀法的第二限制氨基酸為亮氨酸。同時蛋白中還含有8種人體所必需的氨基酸(丙酮沉淀中為7種)，分別占蛋白質(zhì)中總氨基酸含量的40.46%、35.50%和33.08%，造成這一結(jié)果的主要原因是在使用不同溶劑浸提時，蛋白質(zhì)的溶解效果有所差別；必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為0.68、0.54和0.49，其中堿溶酸沉法的結(jié)果符合FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)規(guī)定(40%和0.6)[24]，由此確定堿溶酸沉法效果最為理想。

表2 三種方法提取灰樹花蛋白的氨基酸組成 單位：mg/g

2.4 微量元素分析

礦物質(zhì)是地殼中自然存在的化合物或天然元素，同時也是構(gòu)成人體組織和維持正常生理功能必需的各種元素的總稱，是人體必需的七大營養(yǎng)素之一。表3顯示各種方法提取出的蛋白中礦質(zhì)元素種類及含量，由表3可知，灰樹花蛋白中含有多種礦質(zhì)元素，其中以鈣和鎂為主，可以為機體提供天然的礦物質(zhì)，滿足正常生理代謝需求；同時也含有多種人體所必需的微量元素(鐵、鋅、銅和鉻)和4種是人體可能必需的微量元素(錳、硅、鎳和硼)。通過比較結(jié)果可知，鹽析法的效果較好，各種微量元素含量明顯高于其他2種方法，推測可能是由于鹽析法的制備條件比較溫和，未受到過多外界條件的干擾，并且使用的溶劑為水，相比之下更加有利于元素的析出和溶解。

表3 灰樹花蛋白所含微量元素的種類和含量 單位：mg/g

2.5 灰樹花蛋白的顯微結(jié)構(gòu)

利用掃描電鏡對3種蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)進行觀察[25]，結(jié)果如圖1所示。堿溶酸沉法得到的灰樹花蛋白,整體呈現(xiàn)片狀，邊緣為不規(guī)則鋸齒狀，蛋白表面有輕微褶皺，組織結(jié)構(gòu)較致密，表面平整光滑,與同種方法提取的杏鮑菇蛋白[15]相比，兩者結(jié)構(gòu)存在一定區(qū)別，杏鮑菇蛋白主要呈現(xiàn)為山脊?fàn)睿糠值鞍字虚g有孔洞;觀察圖1-b可知，鹽析法得到的蛋白與圖1-a在一定程度上較為相似，但形態(tài)多樣，有片狀、球狀、桿狀等，可能是由于鹽析過程中溶液鹽濃度的變化導(dǎo)致蛋白分子之間聚合力發(fā)生改變，表面較為粗糙，中間有小孔徑的孔洞，結(jié)構(gòu)組織致密；圖1-c為丙酮沉淀法得到的灰樹花蛋白，外形呈現(xiàn)為大小不規(guī)則的塊狀或顆粒堆積，蛋白表面凹凸不平，組織結(jié)構(gòu)較松散，推測可能是在用有機試劑進行沉淀時，蛋白的表面構(gòu)象和外部形態(tài)發(fā)生變化。

a-堿溶酸沉;b-鹽析;c-丙酮沉淀圖1 灰樹花蛋白的顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Scanning electron microscopy of Grifola frondosa protein

2.6 灰樹花蛋白的功能特性

蛋白質(zhì)是食品中重要的營養(yǎng)成分，其功能特性是其他食品成分不能替代的，對食品的品質(zhì)具有決定性作用。3種提取方法得到的灰樹花蛋白溶液在中性條件下的功能特性如表4所示。三者溶解性較為接近，可能是因為蛋白的疏水性較強，難以與水分子結(jié)合，使得溶解性較低。丙酮沉淀的蛋白持水性為63.94%，遠低于其他2種，可能是丙酮作用時破壞了蛋白表面的極性基團，使該基團分子數(shù)目減少，一般來說蛋白的極性基團分子數(shù)目與持水性呈正相關(guān)。三者之間的起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性大致相同。與堿溶酸沉方法提取的杏鮑菇蛋白[13]相比，灰樹花蛋白的溶解性和持油性更好，這可能與蛋白的微觀結(jié)構(gòu)和非極性側(cè)鏈對油脂的結(jié)合能力有一定關(guān)系。本次試驗丙酮沉淀法得到的蛋白純度過低，對其結(jié)構(gòu)和功能測定缺乏良好的支撐，但試驗均重復(fù)3次，結(jié)果仍具有一定的參考價值，只是不能充分說明蛋白特性。所以此方法下的理化性質(zhì)和功能特性都不如其他2種提取方法，由此可以推斷出丙酮沉淀法并不是一種良好的灰樹花蛋白提取方式。

綜合分析，堿溶酸沉法的各項結(jié)果均優(yōu)于其他2種方法，可能是因為堿溶酸沉法提取的蛋白純度最高、含量較高，因此堿溶酸沉法可被認為是一種灰樹花蛋白的有效提取方法。

表4 灰樹花蛋白功能特性測定結(jié)果 單位：%

3 結(jié)論

本試驗以堿溶酸沉法、鹽析法和丙酮沉淀法提取得到的灰樹花蛋白為研究對象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種方法得到的蛋白在理化性質(zhì)和功能特性方面存在一定差異。對3種方法提取出的蛋白氨基酸進行分析，發(fā)現(xiàn)堿溶酸沉法的結(jié)果較好，氨基酸含量較多。同時3種蛋白中微量元素以鈣和鎂為主，通過比較3種方法所得蛋白的溶解性、吸水和吸油性、起泡性和乳化性可知，堿溶酸沉法得到的蛋白具有更好的理化和功能特性。綜上分析，堿溶酸沉法可被認為是一種有效的蛋白提取方法。本研究為今后灰樹花蛋白的開發(fā)及應(yīng)用提供了相應(yīng)的實驗支撐。