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提取方法對灰樹花粗蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響

2020-11-20 03:44:26彭志杰杜嬌張羽婷郭東東雷佳鈺耿雪冉孟俊龍常明昌
食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年21期
關(guān)鍵詞:鹽析樹花沉淀法

彭志杰,杜嬌,張羽婷,郭東東,雷佳鈺,耿雪冉,2,孟俊龍,2,常明昌,2*

1(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西 晉中,030801)2(山西省食用菌工程技術(shù)研究中心,山西 晉中,030801)

灰樹花(Grifolafrondosa),俗稱蓮花蘑、栗子蘑等[1-2],屬于真菌界、擔(dān)子菌門、擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、多孔菌屬[3],在日本稱之為“舞茸”,屬于珍貴的食藥兩用真菌[4]。

研究表明,灰樹花具有抗病毒、抗生素、抗炎癥、降血糖、降膽固醇和降血壓的功效[5],這得益于其中含有的多種活性物質(zhì),如活性多糖、核酸、多酚和氨基酸等,同時還是一種抗癌藥源[6],因此受到很多消費者的青睞。近年來,國內(nèi)外對灰樹花多糖的研究較多,主要表現(xiàn)在多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)表征及生物活性等方面[5,7-8],而對灰樹花蛋白的研究相對較少,主要集中在提取[9-11]和酶解[12]方面,關(guān)于灰樹花蛋白的理化性質(zhì)及功能特性的研究,國內(nèi)外鮮有報道。

本研究以灰樹花子實體為原料,利用3種方法提取灰樹花蛋白,并對蛋白的理化性質(zhì)、功能特性進行研究,為灰樹花及其粗蛋白在食品加工和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花,浙江慶元縣食用農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)部;

牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250,北京索萊寶生物科技有限公司;大豆油,山西太谷縣農(nóng)貿(mào)市場;NaOH、(NH4)2SO4、石油醚、無水乙醇、丙酮、鹽酸、NaH2PO4、Na2HPO4,均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱(DF205),北京醫(yī)療設(shè)備廠;萬能高速粉碎機(YB-2500A),永康市蘇豐工貿(mào)有限公司;恒溫振蕩水浴鍋(HHS-21-6),上海博訊實業(yè)有限公司;磁力攪拌器(DF-101S),北京中興偉業(yè)儀器有限公司;高速冷凍臺式離心機(Multifuge X1R),貝克曼庫爾特(美國)股份有限公司;真空冷凍干燥機(Alpha 2-4 LS Cbasic),德國CHRIST公司;pH計(Orion Star A),賽默飛世爾科技有限公司;馬弗爐(KSJ),上海電機(集團)公司;高速剪切乳化分散機(FA25),上海弗魯克流體機械制造有限公司;石墨消解儀(SH220 N)、自動凱氏定氮儀(K9840),山東海能科學(xué)儀器有限公司;紫外可見分光光度計(U -1800PC),上海美譜達儀器有限公司;電感耦合等離子體光譜儀(Optima 5300 D ),美國珀金埃爾默儀器有限公司;掃描電鏡(JEOL JEM-6490L ),日本電子儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 灰樹花子實體預(yù)處理

將灰樹花子實體放入50 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干,之后進行粉粹,將粉碎后的子實體粉末過篩。灰樹花粉末和石油醚按照1∶5(g∶mL)的比例進行混合,放到通風(fēng)櫥中攪拌0.5 h,然后再靜置3 h,將上層石油醚回收,剩余部分放置在通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干,待完全干燥后收集粉末,即得到脫脂灰樹花粉末。

1.3.2 灰樹花基本成分測定

蛋白質(zhì)測定:參照GB 5009.5—2016 《食品中蛋白質(zhì)的測定》;水分測定:參照GB 5009.3—2016 《食品中水分的測定》;灰分測定:參照GB 5009.4—2016 《食品中灰分的測定》。

1.3.3 灰樹花蛋白的制備

1.3.3.1 堿溶酸沉法

根據(jù)陳雪洋等[13]的方法,略作修改。將脫脂灰樹花粉末與蒸餾水按照1∶40(g∶mL)混合,用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至13.0,之后將混合液在40 ℃恒溫條件下浸提3 h;6 500 r/min離心15 min,收集上清液;用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH至3.5,并且靜置30 min,6 500 r/min離心15 min,棄去上清液;將沉淀用蒸餾水洗3次,再用0.05 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性,冷凍干燥得到粗蛋白。

1.3.3.2 鹽析法

取適量脫脂灰樹花粉末用蒸餾水溶解,料液比為1∶44(g∶mL),混合后放入水浴鍋中,51 ℃浸提36 min;浸提完成后6 500 r/min離心20 min,收集上清液;按照(NH4)2SO4沉淀表,加入(NH4)2SO4至飽和度為80%,在4 ℃下靜置24 h,6 500 r/min離心20 min,去除上清液,然后將沉淀物溶于適量蒸餾水中透析24 h,冷凍干燥得到粗蛋白。

1.3.3.3 丙酮沉淀法

參照任雨賀等[14]的方法,稍加改動。稱取適量脫脂灰樹花粉末,加入10倍體積的10 mmol/L 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.2)攪拌均勻;將混合物4 ℃浸提120 min。于4 ℃下,6 500 r/min離心20 min,取其上清液于4 ℃保存。再向沉淀中加入等體積的10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.2),進行2次浸提。于4 ℃下,6 500 r/min離心20 min,取上清液,將其與第1次上清液合并。向上述的蛋白粗提液中加入2.0倍體積丙酮,-20 ℃下靜置12 h,6 500 r/min離心30 min,棄去上層液體,下層固形物置于-20 ℃揮干丙酮,再轉(zhuǎn)移至-80 ℃過夜并凍干,蛋白質(zhì)干粉于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 灰樹花蛋白的純度測定

精確稱取適量蛋白樣品并記錄質(zhì)量,移入干燥的定氮瓶中,按照GB 5009.5—2016 《食品中蛋白質(zhì)的測定》進行實驗,并利用自動凱氏定氮儀測定并計算蛋白純度。

1.3.5 灰樹花蛋白氨基酸組成的測定[15]

精確稱取適量樣品,記錄質(zhì)量并放置在備好的安瓿瓶中,按照GB 5009.124—2016 《食品中氨基酸的測定》測定氨基酸種類和含量。

1.3.6 微量元素檢測分析

稱取適量樣品并記錄質(zhì)量,放入坩堝中,之后放到馬弗爐中在500~600 ℃灼燒;待灼燒完成后自然冷卻至室溫,向坩堝中加入適量的體積分數(shù)25% HCl溶液,使坩堝內(nèi)的混合物充分溶解,并定容至25 mL;取適量樣液,利用電感耦合等離子體光譜儀進行測定分析。

1.3.7 掃描電鏡分析

將灰樹花蛋白用雙面膠粘在樣品座上,將樣品座置于離子濺射儀,在樣品表面蒸鍍1層10~20 nm厚的鉑金膜,調(diào)節(jié)電鏡至最佳拍攝視野,并放大至合適倍數(shù),觀察并拍攝相應(yīng)的樣品照片。

1.3.8 溶解性的測定[16]

用去離子水配制10 mL 10 g/L的蛋白溶液,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0,室溫振蕩10 min,4 000 r/min離心20 min,收集上清液采并用Bradford法測定蛋白含量,根據(jù)公式(1)計算蛋白溶解性:

(1)

1.3.9 持水性的測定[16]

準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白樣品,記為m,稱取空離心管質(zhì)量,記為m1,將蛋白樣品放入離心管中,并加入10.0 mL去離子水?;靹蚝箪o置30 min,5 000 r/min離心 20 min,離心結(jié)束后,除去上層清液,稱量此時離心管的質(zhì)量,記為m2。根據(jù)公式(2)計算蛋白的持水性:

(2)

1.3.10 持油性的測定[16]

準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白樣品,記為m,稱取空離心管質(zhì)量,記為m1,將蛋白樣品放入離心管中,并加入10.0 mL大豆油。混勻后靜置30 min,5 000 r/min離心20 min,離心結(jié)束后,除去上層大豆油,稱量此時離心管的質(zhì)量,記為m2。根據(jù)公式(3)計算蛋白的持油性:

(3)

1.3.11 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定[16-17]

用去離子水配制10 g/L的蛋白溶液,量取15 mL蛋白溶液于100 mL的離心管中,體積記為0。利用均質(zhì)機在10 000 r/min條件下均質(zhì)2 min,室溫下測定總體積1,靜置30 min后再次測定總體積2。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別利用公式(4)和(5)進行計算:

(4)

(5)

1.3.12 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定[18-19]

用去離子水配制50 g/L的蛋白溶液,從中量取20 mL的蛋白溶液于100 mL離心管中,40 ℃水浴振蕩反應(yīng)20 min,之后向離心管中再加入20 mL大豆油混合,利用均質(zhì)機在10 000 r/min條件下均質(zhì)3 min;讀取并記錄乳濁液體積,0;乳化層體積,1;然后將乳濁液放入80 ℃水浴鍋中水浴30 min,待反應(yīng)完成后冷卻至室溫,2 000 r/min離心5 min,讀取并記錄剩余乳化層體積2。根據(jù)公式(6)和(7)分別計算乳化性和乳化穩(wěn)定性:

(6)

(7)

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進行3次,利用Excel軟件進行統(tǒng)計和分析、SPSS 25軟件進行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花的基本組成成分

經(jīng)過測定,灰樹花的基本組成成分為水分11.37%、灰分6.94%、蛋白質(zhì)含量19.91%。其中蛋白含量高于杏鮑菇(17.57%)[15]、云耳(10.30%)、銀耳(9.60%)和巖耳(9.00%)[16]。因此可以認為灰樹花是一種高蛋白含量的營養(yǎng)食品,能夠作為潛在的蛋白來源。

2.2 灰樹花蛋白的純度

堿溶酸沉法,即等電點沉淀,是利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低,通過調(diào)節(jié)溶液pH,使蛋白沉淀析出。鹽析沉淀法是利用蛋白質(zhì)在不同鹽濃度條件下溶解度不同特性,通過向提取液中添加一定濃度的中性鹽,使蛋白從溶液中沉淀析出。有機溶劑沉淀法是利用蛋白質(zhì)與其他雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同,通過添加一定量的有機溶劑,使蛋白沉淀析出[20]。因此本試驗利用這3種方法提取蛋白,并對其進行分析研究,以確定灰樹花蛋白提取的最適方法。

經(jīng)凱氏定氮測得3種方法提取得到的蛋白純度如表1所示,堿溶酸沉法得到的蛋白純度最高,達到45.35%,這是因為堿性溶液更有利于蛋白溶出,所以提取的純度更高;鹽析法次之,為35.87%;丙酮沉淀法得到的蛋白純度僅有7.11%,推測原因可能是利用丙酮沉淀蛋白時不完全,并未將全部蛋白沉淀下來。以上結(jié)果初步說明,堿溶酸沉法是一種方便快捷并且效率較好的方法,可以廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的提取。

表1 三種灰樹花蛋白的純度Table 1 Purity of Grifola frondosa protein extracted by three methods

2.3 灰樹花蛋白的氨基酸組成

3種方法提取出的灰樹花蛋白的氨基酸組成見表2,由于本實驗采用酸水解法,在此過程中色氨酸被破壞,無法檢測。3種方式提取的灰樹花蛋白氨基酸種類豐富,共檢測出17種氨基酸(丙酮沉淀法為16種,可能是因為蛋白的提取率過低,導(dǎo)致種類和含量較少),這與杏鮑菇[15]、羊肚菌[21]的檢測結(jié)果基本相近。由表2可知,3種提取方法中谷氨酸含量最高,分別占總氨基酸含量的13.71%、13.83%和14.56%,其次是天冬氨酸。這主要是因為谷氨酸和天冬氨酸均為酸性氨基酸,是食品中重要的鮮味物質(zhì),因此使得灰樹花具有獨特的味道[15,22-23]。3種蛋白的氨基酸組成之間存在較大差異,氨基酸含量各不相同,但是各種氨基酸所占比例大致相同,推測這可能與3種蛋白的純度有關(guān),純度表示為蛋白的有效成分。由表1和表2綜合分析可知,蛋白純度越高,相應(yīng)的氨基酸含量越多。試驗結(jié)果間接表明3種蛋白提取方法的有效性,為不同目的性的蛋白提取提供一定依據(jù)。

堿溶酸沉法、鹽析法與丙酮沉淀法的第一限制氨基酸均為苯丙氨酸,賴氨酸是堿溶酸沉法與鹽析法的第二限制氨基酸,丙酮沉淀法的第二限制氨基酸為亮氨酸。同時蛋白中還含有8種人體所必需的氨基酸(丙酮沉淀中為7種),分別占蛋白質(zhì)中總氨基酸含量的40.46%、35.50%和33.08%,造成這一結(jié)果的主要原因是在使用不同溶劑浸提時,蛋白質(zhì)的溶解效果有所差別;必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為0.68、0.54和0.49,其中堿溶酸沉法的結(jié)果符合FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)規(guī)定(40%和0.6)[24],由此確定堿溶酸沉法效果最為理想。

表2 三種方法提取灰樹花蛋白的氨基酸組成 單位:mg/g

2.4 微量元素分析

礦物質(zhì)是地殼中自然存在的化合物或天然元素,同時也是構(gòu)成人體組織和維持正常生理功能必需的各種元素的總稱,是人體必需的七大營養(yǎng)素之一。表3顯示各種方法提取出的蛋白中礦質(zhì)元素種類及含量,由表3可知,灰樹花蛋白中含有多種礦質(zhì)元素,其中以鈣和鎂為主,可以為機體提供天然的礦物質(zhì),滿足正常生理代謝需求;同時也含有多種人體所必需的微量元素(鐵、鋅、銅和鉻)和4種是人體可能必需的微量元素(錳、硅、鎳和硼)。通過比較結(jié)果可知,鹽析法的效果較好,各種微量元素含量明顯高于其他2種方法,推測可能是由于鹽析法的制備條件比較溫和,未受到過多外界條件的干擾,并且使用的溶劑為水,相比之下更加有利于元素的析出和溶解。

表3 灰樹花蛋白所含微量元素的種類和含量 單位:mg/g

2.5 灰樹花蛋白的顯微結(jié)構(gòu)

利用掃描電鏡對3種蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)進行觀察[25],結(jié)果如圖1所示。堿溶酸沉法得到的灰樹花蛋白,整體呈現(xiàn)片狀,邊緣為不規(guī)則鋸齒狀,蛋白表面有輕微褶皺,組織結(jié)構(gòu)較致密,表面平整光滑,與同種方法提取的杏鮑菇蛋白[15]相比,兩者結(jié)構(gòu)存在一定區(qū)別,杏鮑菇蛋白主要呈現(xiàn)為山脊?fàn)睿糠值鞍字虚g有孔洞;觀察圖1-b可知,鹽析法得到的蛋白與圖1-a在一定程度上較為相似,但形態(tài)多樣,有片狀、球狀、桿狀等,可能是由于鹽析過程中溶液鹽濃度的變化導(dǎo)致蛋白分子之間聚合力發(fā)生改變,表面較為粗糙,中間有小孔徑的孔洞,結(jié)構(gòu)組織致密;圖1-c為丙酮沉淀法得到的灰樹花蛋白,外形呈現(xiàn)為大小不規(guī)則的塊狀或顆粒堆積,蛋白表面凹凸不平,組織結(jié)構(gòu)較松散,推測可能是在用有機試劑進行沉淀時,蛋白的表面構(gòu)象和外部形態(tài)發(fā)生變化。

a-堿溶酸沉;b-鹽析;c-丙酮沉淀圖1 灰樹花蛋白的顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Scanning electron microscopy of Grifola frondosa protein

2.6 灰樹花蛋白的功能特性

蛋白質(zhì)是食品中重要的營養(yǎng)成分,其功能特性是其他食品成分不能替代的,對食品的品質(zhì)具有決定性作用。3種提取方法得到的灰樹花蛋白溶液在中性條件下的功能特性如表4所示。三者溶解性較為接近,可能是因為蛋白的疏水性較強,難以與水分子結(jié)合,使得溶解性較低。丙酮沉淀的蛋白持水性為63.94%,遠低于其他2種,可能是丙酮作用時破壞了蛋白表面的極性基團,使該基團分子數(shù)目減少,一般來說蛋白的極性基團分子數(shù)目與持水性呈正相關(guān)。三者之間的起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性大致相同。與堿溶酸沉方法提取的杏鮑菇蛋白[13]相比,灰樹花蛋白的溶解性和持油性更好,這可能與蛋白的微觀結(jié)構(gòu)和非極性側(cè)鏈對油脂的結(jié)合能力有一定關(guān)系。本次試驗丙酮沉淀法得到的蛋白純度過低,對其結(jié)構(gòu)和功能測定缺乏良好的支撐,但試驗均重復(fù)3次,結(jié)果仍具有一定的參考價值,只是不能充分說明蛋白特性。所以此方法下的理化性質(zhì)和功能特性都不如其他2種提取方法,由此可以推斷出丙酮沉淀法并不是一種良好的灰樹花蛋白提取方式。

綜合分析,堿溶酸沉法的各項結(jié)果均優(yōu)于其他2種方法,可能是因為堿溶酸沉法提取的蛋白純度最高、含量較高,因此堿溶酸沉法可被認為是一種灰樹花蛋白的有效提取方法。

表4 灰樹花蛋白功能特性測定結(jié)果 單位:%

3 結(jié)論

本試驗以堿溶酸沉法、鹽析法和丙酮沉淀法提取得到的灰樹花蛋白為研究對象。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種方法得到的蛋白在理化性質(zhì)和功能特性方面存在一定差異。對3種方法提取出的蛋白氨基酸進行分析,發(fā)現(xiàn)堿溶酸沉法的結(jié)果較好,氨基酸含量較多。同時3種蛋白中微量元素以鈣和鎂為主,通過比較3種方法所得蛋白的溶解性、吸水和吸油性、起泡性和乳化性可知,堿溶酸沉法得到的蛋白具有更好的理化和功能特性。綜上分析,堿溶酸沉法可被認為是一種有效的蛋白提取方法。本研究為今后灰樹花蛋白的開發(fā)及應(yīng)用提供了相應(yīng)的實驗支撐。

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