冷曉飛，張 勃，程德金，周 秘，亓守冰，陳 順，張偉杰

( 1.大連海寶漁業(yè)有限公司，遼寧 大連 116023； 2.乳山市海洋與漁業(yè)監(jiān)督監(jiān)察大隊，山東 威海 264500；3.大連海洋大學，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023； 4.江蘇海洋大學 海洋資源與環(huán)境學院，江蘇 連云港 210095 )

微藻是自然界中的初級生產(chǎn)力，具有繁殖速度快、環(huán)境適應能力強等特點[1]。微藻細胞不僅含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、脂類一般營養(yǎng)物質(zhì)，還含有豐富的維生素、生物素、β-胡蘿卜素和葉酸等特殊營養(yǎng)物質(zhì)。目前微藻培養(yǎng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、飼料、醫(yī)藥以及環(huán)境保護等多個領域已得到廣泛的應用[2]。敞開式培養(yǎng)由于構(gòu)建簡單、成本低廉及操作簡便，是最常用的一種微藻培養(yǎng)方式，尤其是在大規(guī)模的水產(chǎn)動物苗種培育過程中，微藻餌料的培養(yǎng)方式大部分采用敞開式培養(yǎng)[3]。微藻在敞開式培養(yǎng)方式中的生長易受溫度、光照和營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子制約，而關(guān)于提高微藻培養(yǎng)密度和產(chǎn)量方面的研究也多集中于探討最佳培養(yǎng)基環(huán)境[4-7]，對敞開式培養(yǎng)操作方式的研究則相對較少。

水產(chǎn)動物微藻餌料的敞開式培養(yǎng)在接種施肥后，采取的主要操作方式為攪池，目的是防止藻體

沉降和凝結(jié)成塊，促進氣體交換，加快光合作用過程中氧氣的釋放和二氧化碳的帶入。許多研究中以充氣作為攪池和增加二氧化碳的方式。王艷等[8]研究發(fā)現(xiàn)，充氣和攪動均能促進球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)囊體的形成，試驗組中囊體密度高于對照組。吳紅艷等[9]發(fā)現(xiàn)充氣培養(yǎng)的鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)其類胡蘿卜素及藻藍蛋白與葉綠素a含量比例的增長要高于靜止培養(yǎng)的螺旋藻，同時該研究還發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中，通過攪拌以釋放培養(yǎng)液中的溶解氧，減少由紫外輻射所帶來的傷害也是十分必要的。水產(chǎn)動物餌料生產(chǎn)中，攪池多采用人工方式(即每日由餌料培養(yǎng)人員進行若干次攪池)，其缺點是耗費人力且攪動效果差，而其他攪池方式如充氣攪池、機械臂攪池等需要配備氣體消毒設備或機械設備，且操作不慎易造成污染。在微藻敞開式培養(yǎng)中，如何優(yōu)化

攪池效果亟待研究。

造流泵應用于水族缸中可起到營造自然水流的作用，由于安裝方便，可應用于微藻敞開式培養(yǎng)替代人工攪池操作。筆者通過監(jiān)測不同造流組中小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissima)的生長及培養(yǎng)水體水質(zhì)因子的變化，分析造流方式在微藻敞開式培養(yǎng)中的應用潛力，研究結(jié)果將為提高水產(chǎn)動物微藻餌料培養(yǎng)效率提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小新月菱形藻一級藻種來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室。對其進行二級擴培后，用于各試驗組的接種。

1.2 試驗方法

利用造流泵(天津森森水族用品有限公司)實現(xiàn)對培養(yǎng)水體的造流，設置3個不同功率的造流培養(yǎng)組，分別為3 W(型號JVP-101)、6 W(型號JVP-102)和12 W(型號JVP-200)，對應流量分別為2000、3000、5000 L/h，同時設置1個對照組，用普通攪拌耙攪池，每個處理設置3個平行。

試驗組及對照組微藻培養(yǎng)容器采用12個完全一致的53 cm×72 cm×58 cm 200 L水桶，培養(yǎng)海水經(jīng)500目篩絹過濾并經(jīng)二氧化氯消毒，培養(yǎng)基施加康威營養(yǎng)液。試驗組不同功率的造流泵均固定于培養(yǎng)容器長面距底20 cm處(圖1)，且調(diào)整造流泵使水流角度朝向桶底與水平面呈45°以保證造流時整體水體能混合均勻。

試驗組與對照組同時接種，3、6、12 W和對照組的接種密度均設置為7.0×104個/mL，由于培養(yǎng)水體實際大小與估計值略有差異，接種后的實際初始密度分別為(6.8±0.2)×104個/mL、(6.8±0.3)×104個/mL、(6.3±0.6)×104個/mL、(8.3±0.8)×104個/mL，經(jīng)統(tǒng)計分析各組間無顯著差異。試驗共進行6 d，接種后各造流組造流泵連續(xù)運轉(zhuǎn)至試驗結(jié)束，對照組每日攪池3次，攪池時間為8:00、12:00和18:00。培養(yǎng)期間采用車間內(nèi)自然光照，8:00培養(yǎng)水體上方光照度為3760～15 853 lx，12:00光照度為14 723～19 997 lx，18:00光照度為413～6633 lx，各培養(yǎng)水槽光照度一致。

1.3 數(shù)據(jù)測量

每日8:00和18:00從各試驗組與對照組培養(yǎng)容器中取樣，利用血球計數(shù)板在10倍目鏡、40倍物鏡下計藻細胞密度，每個樣品重復計數(shù)3次，求其平均值。每日8:00、12:00和18:00(分別記做M、N和E)使用水質(zhì)儀(Thermo Orion Star A216)測量水質(zhì)指標(pH、鹽度、溫度)，并使用照度計(嘉定學聯(lián)ZDS-10型)測量培養(yǎng)水體表面光照度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差方法分析造流對各取樣時間點上藻細胞密度、培養(yǎng)水體溫度、pH及鹽度的影響，之后采用S-N-K多重比較方法對各功率造流水平間進行多重比較。利用相關(guān)分析對培養(yǎng)水體的pH與藻細胞密度進行相關(guān)性分析，并進行回歸分析。所有統(tǒng)計分析均在SPSS 17.0中完成，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同造流程度對小新月菱形藻培養(yǎng)密度的影響

各試驗組藻細胞密度隨培養(yǎng)時間的變化見圖2。造流對藻細胞培養(yǎng)密度的提升具有明顯效果，試驗開始后第3 d上午(3 M)，3個造流組內(nèi)藻細胞密度即顯著高于對照組(P<0.05)，但3個造流組間無顯著差異。自第4 d上午(4 M)開始，12 W造流組內(nèi)藻細胞密度顯著高于6 W和3 W造流組，后二者間無顯著差異。自第5 d上午(5 M)開始至試驗結(jié)束，4個組(3個造流組和1個對照組)兩兩之間均存在顯著差異，藻細胞密度均依次為12 W>6 W>3 W>對照組。第6 d后，對照組的藻細胞密度開始下降，而3個造流組仍保持上升趨勢，至第6 d傍晚(6 E)收獲時，3、6 W和12 W 3個造流組內(nèi)藻細胞密度分別為(116.7±4.5)×104個/mL、(133.8±4.0)×104個/mL和(144.5±3.8)×104個/mL，分別較對照組內(nèi)藻密度(76.3±4.7)×104個/mL提高53.1%、74.6%和93.1%。

2.2 培養(yǎng)水體狀態(tài)

造流組培養(yǎng)水體在造流作用下不停翻滾，且翻滾速度隨造流功率的增加而加快。強光照射下，對照組培養(yǎng)水體可觀察到顆粒狀結(jié)塊，造流泵組培養(yǎng)水體呈現(xiàn)出煙霧狀，無顆粒狀結(jié)塊形成(圖3)。

圖2 各試驗組小新月菱形藻細胞密度隨時間的變化Fig.2 Changes in cell density of alga N. closterium f. minutissima with cultivation time in various groups同一個時間點上，標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.Means with different letters in the same time are significantly different (P<0.05)； et sequentia.

圖3 對照組(a)與造流組(b)培養(yǎng)水體狀態(tài)Fig.3 Culture water status in control group (a) and flow making group (b)

2.3 造流對小新月菱形藻培養(yǎng)水體水質(zhì)因子的影響

培養(yǎng)水體的溫度隨晝夜時間產(chǎn)生波動，每日上午溫度逐漸升高，到傍晚溫度達到最高(圖4)。方差分析結(jié)果表明，從第1 d傍晚(1 E)開始到試驗結(jié)束，造流始終顯著影響培養(yǎng)水體的溫度(P<0.05)。對照組溫度始終最低，且始終顯著低于12 W造流試驗組的溫度(P<0.05)；自第5 d開始至試驗結(jié)束，6 W造流組的溫度始終顯著高于對照組(P<0.05)，而3 W造流組僅在第5 d中午、傍晚(5 N、5 E)和第6 d中午(6 M)等時間點顯著高于對照組；從培養(yǎng)的第4 d開始，3個造流組間的溫度在大多數(shù)時間點上差異顯著(P<0.05)，12 W造流組最高，6 W次之，3 W最低。至培養(yǎng)結(jié)束，各組水溫依次為12 W[(19.91±0.41) ℃]>6 W[(19.48±0.15) ℃]>3 W[(19.11±0.13) ℃]>對照組[(18.66±0.14) ℃]。

各試驗組培養(yǎng)基pH隨培養(yǎng)時間的變化見圖5。培養(yǎng)過程中各組培養(yǎng)水體的pH均呈逐漸升高趨勢。培養(yǎng)開始后的前4 d，各組pH無顯著差異。第5 d后至試驗結(jié)束，造流對培養(yǎng)水體pH具有顯著影響，對照組pH始終顯著低于12 W造流組(P<0.05)；從第5 d中午(5 N)開始，對照組pH始終顯著低于各造流組(P<0.05)，各造流組間無顯著差異。至試驗結(jié)束，各組pH依次為6 W(10.02±0.10)>3 W(9.98±0.09)>12 W(9.94±0.11)>對照組(9.34±0.12)。

圖4 各試驗組培養(yǎng)水體溫度隨時間的變化Fig.4 Changes in water temperature in culture medium in various groups with cultivation time

圖5 各試驗組培養(yǎng)基pH隨時間的變化Fig.5 Changes in water pH in culture medium in various groups with cultivation time

各組培養(yǎng)基鹽度隨培養(yǎng)時間的變化見圖6。培養(yǎng)過程中各組培養(yǎng)水體的鹽度均呈緩慢升高趨勢，但變化幅度不大，為32.93～33.59。從培養(yǎng)第1 d中午(1 N)開始至試驗結(jié)束，12 W造流組的鹽度始終最高，在第5 d后的大部分時間點均顯著高于對照組(P<0.05)；6 W和3 W造流組培養(yǎng)水體的鹽度與對照組均無顯著差異。

2.4 小新月菱形藻培養(yǎng)密度與培養(yǎng)水體pH的相關(guān)分析

培養(yǎng)水體pH與藻細胞密度之間的相關(guān)性分析見表1。4個試驗組的藻細胞密度和培養(yǎng)水體pH間的相關(guān)系數(shù)為0.923～0.975，各相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水平(P<0.01)。造流組培養(yǎng)水體pH與藻密度間的相關(guān)系數(shù)高于對照組。

圖6 各試驗組培養(yǎng)基鹽度隨時間的變化Fig.6 Changes in water salinity in culture medium in various groups with cultivation time

表1 培養(yǎng)水體pH與藻細胞密度之間的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis between culture water pH andalgal cell density

回歸分析結(jié)果表明，藻細胞密度(y)和pH(x)呈二次曲線回歸關(guān)系，對照組中藻細胞密度和pH的二次回歸方程為y=21.822x2-309.26x+1067.3(r2=0.8588)(圖7a)；3 W試驗組中藻細胞密度和pH的二次回歸方程為y=-28.421x2+588.69x-2926.2(r2=0.9663)(圖7b)；6 W試驗組中藻細胞密度和pH的二次回歸方程為y=-20.096x2+444.46x-2300.2(r2=0.9685)(圖7c)；12 W試驗組中藻細胞密度和pH的二次回歸方程為y=-026.499x2+565.89x-2861.1(r2=0.9525)(圖7d)。

3 討 論

3.1 造流對小新月菱形藻生長的影響

造流顯著提高了小新月菱形藻的培養(yǎng)密度，至收獲時，3、6 W和12 W 3個造流組內(nèi)藻細胞密度分別較對照組提高53.1%、74.6%和93.1%。造流組藻細胞密度顯著提高的主要原因應該是造流打破了靜水培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)水體的光衰減規(guī)律，提高了藻細胞的光暗交替頻率。在微藻的培養(yǎng)過程中存在光衰減現(xiàn)象，藻密度和光程的增加會使光衰減程度大幅增加[10-12]。孫穎穎等[10]研究表明，OD680值為0.664的小新月菱形藻，光程為7 cm時的光衰減程度就高達70.8%，而當OD680達到1.435時，5 cm以上的光程后幾乎無光；耿金峰等[13]研究表明，13 cm光程反應器南北擺放時可有效提高眼點擬微綠球藻(Nannochlorisoculata)的產(chǎn)量。本研究中的對照組是水產(chǎn)動物餌料生產(chǎn)中普遍使用的方式，此方式除了每日幾次的攪動，大部分時間為靜水培養(yǎng)模式，在培養(yǎng)早期(如第3 d中午以前，圖2)，由于藻細胞密度較低，光衰減現(xiàn)象不明顯，藻細胞能保持較快的生長速度，因此與造流組無顯著差異，而隨著藻細胞密度的增加，光衰減程度加劇，在不攪動的情況下，培養(yǎng)水體內(nèi)的大部分微藻細胞只能接受到非常弱的光照甚至不能接受到光照，因此生長出現(xiàn)光能限制[14]；相對于對照組，造流組增強了藻細胞在光照方向上的混合，藻細胞的光暗交替頻率大幅提高，因此生長速度得到顯著提高。造流功率的增加加快了藻細胞在光照方向上的混合速度從而提高了藻細胞的光暗交替頻率，這一優(yōu)勢在藻密度升高后(第4 d中午后，圖2)更加明顯，因此藻細胞的生長速度會隨著造流功率的升高顯著增加。王艷等[8]研究發(fā)現(xiàn)，攪動提高了球形棕囊藻囊體內(nèi)細胞的生長速度，但攪動程度之間并不存在顯著差異，原因是其使用的是1000 mL錐形瓶，藻細胞的生長受光衰減的影響較小。諸發(fā)超等[15]通過研究敞開式跑道池光生物反應器內(nèi)的粒子運動軌跡，發(fā)現(xiàn)僅依靠蹼輪使培養(yǎng)水體在跑道池內(nèi)流動，藻細胞的運動方向始終為水平，沒有光暗區(qū)之間的交換，而在此基礎上增加充氣后，藻細胞的運動方向為螺旋運動，光暗交替頻率顯著提升，藻細胞生長速度顯著提高?？梢?，向敞開式培養(yǎng)水體中設置造流泵優(yōu)于僅設置蹼輪或類似的機械臂，可同時實現(xiàn)蹼輪結(jié)合充氣的功能。由于設置造流泵的方式簡單易行，因此此方法非常適用于提高水產(chǎn)動物育苗過程中的餌料培養(yǎng)效率。根據(jù)本試驗結(jié)果，可在藻細胞密度低于60×104個/mL時使用低功率的造流泵(3 W/200 L)，在高于該密度后，使用高功率造流泵(12 W/200 L)，以節(jié)約能源。

3.2 造流泵對培養(yǎng)水體狀態(tài)及水質(zhì)因子的影響

造流組培養(yǎng)水體中的藻細胞呈現(xiàn)出煙霧狀態(tài)(圖3a)，而對照組中出現(xiàn)顆粒狀結(jié)塊(圖3b)，這種顆粒結(jié)塊可能是藻細胞與其代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)凝結(jié)而成，其對餌料培養(yǎng)和使用十分不利，它們會成為細菌及原生動物的培養(yǎng)基，從而導致餌料培養(yǎng)失敗，即使可用于投喂，也會在投喂后很快沉入池底，降低餌料效果。造流組內(nèi)由于培養(yǎng)水體的快速流動使藻細胞不易與培養(yǎng)基中的雜質(zhì)凝結(jié)，有效避免了結(jié)塊的形成，因此提高了餌料質(zhì)量和使用效果。

工廠化微藻餌料車間為達到采光需求，多采用透明材質(zhì)房頂，這使得餌料車間保溫性低，晝夜溫差較大。本試驗中也使用了相同的餌料車間，由于培養(yǎng)水體較小，各組培養(yǎng)水體的溫度隨晝夜產(chǎn)生波動：每日早上開始逐漸升溫，傍晚時達到最高，次日早上又回落至最低(圖4)。造流組的升溫或降溫速度與對照組基本一致，表明造流并未明顯加速培養(yǎng)水體與空氣之間的熱交換。造流組尤其是12 W和6 W造流組在多個時間點上的溫度顯著高于對照組，這可能是由于造流泵發(fā)熱所致。李炳乾等[16]研究認為，小新月菱形藻的最佳生長溫度為15～20 ℃，梁英等[17]研究認為，小新月菱形藻生長適宜溫度為10～25 ℃，最適溫度為20 ℃，因此，本試驗中大部分時間內(nèi)各培養(yǎng)水體的溫度(14～19 ℃)屬小新月菱形藻的最佳生長溫度。在此溫度范圍內(nèi)，藻細胞的生長速度將隨溫度的上升而逐漸升高，從這一角度看，造流組內(nèi)小新月菱形藻的生長速度快還得益于溫度的升高。本試驗中各培養(yǎng)水體的pH隨培養(yǎng)時間的增長有較大幅度的升高(圖5)，這是由于微藻進行光合作用時除了直接利用CO2外，還以HCO3-的形式利用CO2[18]，隨著藻細胞密度的增加，培養(yǎng)水體對空氣中CO2的捕獲能力變強，CO2與水體中的H+結(jié)合造成了OH-濃度的增加，因此使pH升高[19-22]。從第5 d中午(5 N)到試驗結(jié)束，造流組的pH始終顯著高于對照組，這應該是由于藻細胞密度增加后，造流組和對照組受光衰減影響的程度不同從而造成二者光合作用效率的不同所致：造流組受光衰減影響程度較低，藻細胞始終保持較強的光合作用(圖2)，因此培養(yǎng)水體的pH保持了原來的升高速度，而對照組受光衰減影響大，光合作用快速減弱，因此培養(yǎng)水體pH升高的速度也快速下降。孟范平等[23]研究發(fā)現(xiàn)，小新月菱形藻可在pH 4～8內(nèi)正常生長。本研究中小新月菱形藻在pH接近10的培養(yǎng)水體中仍能快速生長，因此可認為小新月菱形藻對較高的pH也有較強的耐受能力。Zhu等[24]研究表明，pH升高后的培養(yǎng)水體能從空氣中捕獲更多的CO2從而更有利于微藻的光合作用和生長，即pH升高和CO2利用可形成良性循環(huán)，在這一良性循環(huán)中，通過造流以保持高的光合作用效率可能對藻細胞的持續(xù)快速生長起到重要作用。在培養(yǎng)過程中各組的鹽度均呈緩慢升高趨勢，這應該是培養(yǎng)水體蒸發(fā)所致。從開始培養(yǎng)到收獲，各組鹽度變化值均較小(圖6)，說明各組培養(yǎng)水體的蒸發(fā)量均較低。12 W造流組的鹽度始終最高，在第5 d后的大部分時間點均顯著高于對照組，這應該與該組培養(yǎng)水體溫度高，蒸發(fā)量較大所致。盡管12 W造流組鹽度最高，但與各組差值不足0.2，因此蒸發(fā)量的差異幾乎不會對藻細胞的密度測量帶來誤差。

各組的藻細胞密度均和培養(yǎng)水體的pH極顯著相關(guān)，這與張青田等[25]對銅綠微囊藻的研究結(jié)果一致。本研究利用回歸分析得到了利用pH預測藻密度的回歸模型，相對于對照組，3個造流組的預測模型的決定系數(shù)r2更高，這表明在造流情況下獲得的回歸方程預測準確性更高。

4 結(jié) 論

在微藻敞開式培養(yǎng)中進行造流能顯著提高微藻的生長速率，3、6 W和12 W 3個造流組內(nèi)藻細胞密度分別較對照組提高53.1%、74.6%和93.1%，這得益于造流能提高藻細胞的光暗交替頻率，并能進一步提高pH以增加CO2的利用效率。此外，造流還能消除餌料結(jié)塊現(xiàn)象，提高餌料的質(zhì)量和利用效率。由于造流簡單易行，該方法適用于提高水產(chǎn)動物育苗過程中餌料培養(yǎng)的效率，在實際使用中，根據(jù)微藻的生長逐漸增大造流泵的功率預計將取得更好的培養(yǎng)效果。