劉麗麗，張 蓉，王曉雯，朱 華

( 北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068 )

硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)是一種?；o酶A，是單不飽和脂肪酸合成途徑的限速酶[1]，通過(guò)調(diào)控脂肪酸代謝過(guò)程改變細(xì)胞膜流動(dòng)性[2]，在細(xì)胞膜應(yīng)對(duì)低溫脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。硬脂酰輔酶A去飽和酶廣泛存在于單細(xì)胞生物[4]、哺乳動(dòng)物[5]和人類(lèi)[6]體內(nèi)，在許多水生動(dòng)物中也報(bào)道了硬脂酰輔酶A去飽和酶的活力和基因表達(dá)，包括鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[7]、斑馬魚(yú)(Daniorerio)[8]、莫桑比克羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)[1,9]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)[10]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[11]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[12]、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[13]、普通章魚(yú)(Octopusvulgaris)[14]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)[15]等。硬脂酰輔酶A去飽和酶在魚(yú)類(lèi)應(yīng)對(duì)低溫脅迫的過(guò)程中具有重要作用[3]。低溫馴化過(guò)程中遮目魚(yú)(Chanoschanos)肝細(xì)胞膜的脂肪酸組成與硬脂酰輔酶A去飽和酶變化顯著，肝細(xì)胞微粒體硬脂酰輔酶A去飽和酶活性與單不飽和脂肪酸含量具有相關(guān)性[16]；通過(guò)改變飼料配方提高羅非魚(yú)Scd1轉(zhuǎn)錄本含量和活性，脂肪酸不飽和指數(shù)(C16:1/C16:0；C18:1/C18:0)相應(yīng)變化，能夠提高羅非魚(yú)低溫耐受能力[17]。

虎皮魚(yú)[Puntius(Puntigrus)tetrazona]是一種廣受水族愛(ài)好者歡迎的小型熱帶觀賞魚(yú)，成魚(yú)體長(zhǎng)5～7 cm。體表淺黃或棕黃色，上覆4條垂直的濃黑色條紋，因體表斑斕似虎紋，故稱(chēng)為虎皮魚(yú)，學(xué)名四帶無(wú)須?；⑵~(yú)對(duì)溫度變化十分敏感，屬于狹溫?zé)釒~(yú)類(lèi)，適宜水溫23～28 ℃[18]。溫度降低則體色暗淡、婚姻色減退、攝食力減弱、游動(dòng)遲緩，導(dǎo)致生病甚至死亡。由于這一生物學(xué)特性，虎皮魚(yú)的生產(chǎn)養(yǎng)殖嚴(yán)重受制于季節(jié)性氣候變化和晝夜溫差。在生產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，漁場(chǎng)通常依賴(lài)地?zé)峄蛎禾咳紵３诌m宜水溫；在終端消費(fèi)市場(chǎng)，觀賞魚(yú)愛(ài)好者通常使用加熱棒保持水溫恒定，需要較大的能源消耗，提高虎皮魚(yú)低溫耐受能力具有重要的實(shí)踐意義[3]。

筆者通過(guò)RACE技術(shù)克隆虎皮魚(yú)Scd1(PtScd1)基因cDNA序列，分析序列同源性，預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框(ORF)和氨基酸序列結(jié)構(gòu)，構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型；檢測(cè)PtScd1基因在虎皮魚(yú)不同組織中的特異性表達(dá)，分析梯度低溫脅迫下PtScd1基因表達(dá)水平的變化，明確PtScd1基因在成年虎皮魚(yú)體內(nèi)存在組織特異性和溫度誘導(dǎo)型表達(dá)特征，研究結(jié)果將為提高虎皮魚(yú)低溫存活率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 虎皮魚(yú)養(yǎng)殖

虎皮魚(yú)在本實(shí)驗(yàn)室完成馴化后長(zhǎng)期養(yǎng)殖，養(yǎng)殖條件為：水溫25～27 ℃，pH 6.5～7.4，硬度6～7，養(yǎng)殖系統(tǒng)具備獨(dú)立循環(huán)過(guò)濾和連續(xù)曝氣裝置，每日定時(shí)定量投喂商品干飼料2次，投喂10 min后吸除飼料殘?jiān)?/p>

1.1.2 梯度低溫脅迫試驗(yàn)

挑選體型規(guī)格相近、健康活潑的8月齡虎皮魚(yú)150尾(不分雌雄)，用于梯度低溫脅迫試驗(yàn)。將150尾虎皮魚(yú)隨機(jī)分為5個(gè)養(yǎng)殖缸，每個(gè)養(yǎng)殖缸30 L，含有30尾虎皮魚(yú)。試驗(yàn)第1 d水溫保持27 ℃，次日起每24 h降低溫度如下：△T1=4 ℃/d，△T2=4 ℃/d，△T3=4 ℃/d，△T4=2 ℃/d，其他條件維持不變。各溫度梯度維持24 h后，每缸隨機(jī)取3尾虎皮魚(yú)(圖1)，間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(Sigma-Aldrich，E10521，商品名MS-222)溶液麻醉后，解剖腦、鰓、肝臟和肌肉組織，液氮速凍，超低溫冰箱(Thermo，F(xiàn)orma 88000)-80 ℃保存。試驗(yàn)共3個(gè)平行。

圖1 虎皮魚(yú)梯度低溫脅迫與取樣流程Fig.1 The gradient cooling stress and sampling procedure in tiger skin barb P. tetrazona

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

虎皮魚(yú)腦、鰓、肝臟和肌肉組織自超低溫冰箱取出后，立即加入組織總RNA提取試劑RNAiso Plus(TaKaRa，D9108A)，組織勻漿儀(MP，F(xiàn)astPrep-24)進(jìn)行組織破碎和勻漿，提取總RNA，操作按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Nanodrop2000核酸蛋白濃度檢測(cè)儀測(cè)定總RNA濃度和污染情況，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，超低溫冰箱-86 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA第一鏈合成與保守序列克隆

分別以腦、鰓、肝臟和肌肉總RNA為模板，采用1st strand cDNA合成試劑盒(TaKaRa，6110A)合成cDNA第一鏈。Nanodrop2000核酸蛋白濃度檢測(cè)儀測(cè)定cDNA產(chǎn)物濃度和純度，超低溫冰箱-86 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中公布的魚(yú)類(lèi)Scd1基因cDNA保守序列，利用CODEHOP軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物SCD-MAFQ-F、SCD-MWGN-R，SCD-VMFQ-F、SCD-NYHH-R(表1)。按照Ex Taq酶(TaKaRa，DRR001A)說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，按照如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，送交擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 RACE克隆

根據(jù)簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增獲得PtScd1 cDNA部分保守序列，Primer3Web(http://primer3.ut.ee/)在線(xiàn)設(shè)計(jì)引物SCDGSP1和SCDNGSP1用于5′RACE擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物SCDGSP2和SCDNGSP2用于3′RACE擴(kuò)增。采用SMARTer RACE 5′/3′ Kit(Clontech，634858)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，以肝臟組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到PtScd1 cDNA的5′和3′ RACE產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，凝膠DNA回收試劑盒(TaKaRa，9762)回收目的條帶DNA，送交擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，采用SeqMan軟件對(duì)測(cè)序片段與得到的虎皮魚(yú)Scd1 cDNA部分保守序列進(jìn)行拼接。以肝臟組織總RNA為模板，ScdCDS-F和ScdCDS-R為引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.4 cDNA序列結(jié)構(gòu)分析與氨基酸序列預(yù)測(cè)

拼接序列經(jīng)BLAST在線(xiàn)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì)，結(jié)果表明該序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)公布的Scd1 cDNA序列具有高度同源性；使用ClustalX2和DNAMAN軟件

表1 研究所用引物信息Tab.1 Information list of the primer used in the experiment

進(jìn)行序列同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心ORFfinder在線(xiàn)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(ORF)和可能編碼的氨基酸序列。通過(guò)BankIt(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/)將PtScd1 cDNA序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。CDD數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域。Swiss-Model在線(xiàn)(https://swissmodel.expasy.org/)，ProMod3 Version 2.0.0進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR

根據(jù)獲得的PtScd1 cDNA序列，Primer3Web(http://primer3.ut.ee/)在線(xiàn)設(shè)計(jì)引物SCD-qF和SCD-qR用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)(表1)。以本研究中獲得的腦、鰓、肝臟和肌肉組織cDNA為模板，虎皮魚(yú)gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因(表1)，按照熒光定量PCR試劑盒(天根，F(xiàn)P209)說(shuō)明書(shū)配制20 μL反應(yīng)體系，在ABI StepOne Plus熒光定量PCR儀器進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸(采集信號(hào))30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)信號(hào)采集程序?yàn)椋?5～60 ℃，2.5 ℃/s。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與繪圖

OriginPro 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖，單因素方差分析檢驗(yàn)顯著性水平，Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差同質(zhì)性分析，LSD和S-N-K方法進(jìn)行事后多重檢驗(yàn)。所有數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié) 果

低溫脅迫過(guò)程中，虎皮魚(yú)逐漸死亡；當(dāng)溫度降至13 ℃時(shí)，累積死亡率約達(dá)50%。試驗(yàn)過(guò)程中，以停止呼吸為死亡指標(biāo)，隨時(shí)移除死亡虎皮魚(yú)。

2.1 虎皮魚(yú)Scd1(PtScd1)基因cDNA序列結(jié)構(gòu)與保守性分析

通過(guò)RACE克隆和序列拼接獲得一段1338 bp的虎皮魚(yú)Scd1基因cDNA序列，將其命名為PtScd1，序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上傳(登錄號(hào)：MN364671)。Blastn序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PtScd1 mRNA序列與鯉魚(yú)(U31864.2)、團(tuán)頭魴(KF918746.1)、草魚(yú)(KF918746.1)、大菱鲆(KC189928.1)、矛尾復(fù)蝦虎魚(yú)(Acanthogobiushasta，KT384417.1)和斑馬魚(yú)(NM_198815.2)Scd1 cDNA的序列相似度分別為88.58%、83.84%、83.84%、82.05%、79.98%和79.03%。

ORFfinder預(yù)測(cè)PtScd1 開(kāi)放閱讀框位于cDNA序列94～1074位，包含981個(gè)核苷酸，編碼326個(gè)氨基酸。將PtScd1開(kāi)放閱讀框序列與鯉魚(yú)、團(tuán)頭魴和斑馬魚(yú)Scd1 mRNA序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其序列相似度分別為88.52%、83.49%和79.36%，表明PtScd1基因編碼序列與魚(yú)類(lèi)相比具有高度保守性(圖2)。

2.2 PtSCD1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)PtScd1基因開(kāi)放閱讀框編碼326個(gè)氨基酸，該氨基酸序列命名為PtSCD1，蛋白質(zhì)分子量37.62 ku。PtSCD1氨基酸序列33～311位比對(duì)到脂肪酸去飽和酶保守結(jié)構(gòu)域(序列號(hào)：pfam00487)，長(zhǎng)度為248個(gè)氨基酸，二進(jìn)制值為63.12，期望值為1.96×10-11(圖3)。

Swiss-Model同源建模發(fā)現(xiàn)，PtSCD1蛋白與4ymk.1.A(PDB，2019-08-02)序列同源性高達(dá)63.34%，屬于單體蛋白，序列相似性為0.5，比對(duì)范圍氨基酸序列第6～326位，覆蓋度95%，序列比對(duì)表明，其蛋白功能為酰基輔酶A去飽和酶1。根據(jù)其三維結(jié)構(gòu)(圖4)，預(yù)測(cè)PtSCD1蛋白有2個(gè)高度保守的鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，有2個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)，分別和硬脂酰輔酶A(ST9)、(Z)-十八碳-9-羥基-(2R)-2,3-二氧氮自由基丙酸(MPG)結(jié)合，但是這2個(gè)配體的結(jié)合位點(diǎn)序列保守性很差。

圖2 PtScd1基因開(kāi)放閱讀框序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 The BLAST results of PtScd1 gene open reading frame sequence 表示序列相似度75%， 表示序列相似度50%，…表示序列缺失. indicates 75% sequence similarity, indicates 50% sequence similarity, … indicates sequence loss.

圖3 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 The prediction of the protein conserved domain

圖4 PtSCD1蛋白三維結(jié)構(gòu)模式Fig.4 The three dimensional structure model of PtSCD1 protein

2.3 PtScd1轉(zhuǎn)錄本組織特異性與溫度誘導(dǎo)表達(dá)

qPCR分析發(fā)現(xiàn)，PtScd1在不同組織(27 ℃)中的表達(dá)水平依次為肝臟>腦>肌肉>鰓(圖5)。在梯度低溫脅迫(23、19、15、13 ℃)下，基因表達(dá)水平上調(diào)。在腦組織中PtScd1轉(zhuǎn)錄本豐度與溫度相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)泊松系數(shù)為-0.97(P<0.01)，表明腦組織中PtScd1轉(zhuǎn)錄本豐度與溫度具有負(fù)相關(guān)性，隨著溫度降低，PtScd1轉(zhuǎn)錄本依賴(lài)性上調(diào)表達(dá)。低溫脅迫下鰓和肌肉組織PtScd1轉(zhuǎn)錄本豐度均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組，肝臟組織13 ℃處理組PtScd1轉(zhuǎn)錄本豐度也顯著高于其對(duì)照組(P<0.01)。

圖5 PtScd1轉(zhuǎn)錄本相對(duì)表達(dá)水平定量分析Fig.5 The comparative quantitative analysis of PtScd1 transcripts abundancea.虎皮魚(yú)腦、鰓、肝臟和肌肉組織PtScd1表達(dá)水平定量分析(log10)，其中以腦組織為對(duì)照組，所有樣品處理溫度均為27 ℃，上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；b.低溫脅迫下虎皮魚(yú)各組織PtScd1表達(dá)水平定量分析，每個(gè)組織中以27 ℃處理組作為對(duì)照組；c.腦組織PtScd1轉(zhuǎn)錄本豐度與溫度相關(guān)性分析的散布矩陣圖，r2=-0.97，P<0.01；圖中所有數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*表示與同一組織樣品對(duì)照組(27 ℃)有顯著差異(P<0.01).a.the comparative quantitative analysis of PtScd1 transcripts abundance in brain, gill, liver and muscle tissues of P. tetrazona with brain tissue as control group, and all tissue samples are treated at 27 ℃, and means with different letters are significant difference (P<0.05); b.the quantitative analysis of PtScd1 transcripts abundance under gradient cold stress with 27 ℃ treatment as control group; c. the scatter matrix of correlation between temperature and PtScd1 transcripts abundance. r2=-0.97, P<0.01; all the values are expressed as mean±SD. * indicates significance difference compared to control group (27 ℃), P<0.01.

3 討 論

細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的修飾是變溫動(dòng)物對(duì)溫度變化的普遍應(yīng)答方式，這一機(jī)制稱(chēng)為恒黏適應(yīng)性機(jī)制[19]。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞膜對(duì)低溫脅迫的恒黏適應(yīng)性主要是通過(guò)改變膜脂的組成和結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的，不飽和脂肪酸鏈的改變會(huì)導(dǎo)致磷脂雙分子層曲率和流動(dòng)性的變化，從而改變細(xì)胞膜的構(gòu)象和功能性[20-21]。不飽和脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)中合成后，經(jīng)過(guò)第一步去飽和作用，隨后經(jīng)過(guò)延伸、去飽和，定向分流用于甘油三磷脂、膽固醇酯和磷脂合成。硬脂酰輔酶A去飽和酶參與第一步的去飽和作用，在脂肪酸鏈的2個(gè)碳原子之間形成雙鍵，生成單不飽和脂肪酸，是不飽和脂肪酸合成途徑的限速步驟。

3.1 虎皮魚(yú)PtScd1 cDNA序列

本研究以虎皮魚(yú)肝臟組織總RNA為模板，克隆到一段Scd1 cDNA序列，序列全長(zhǎng)1338 bp，其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度981 bp，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與Scd1序列具有較高相似度，確定其為虎皮魚(yú)Scd1基因序列，因此命名為PtScd1。

目前已知Scd基因存在多種亞型。人類(lèi)體內(nèi)有2個(gè)亞型Scd1和Scd5[22]，小鼠體內(nèi)有4個(gè)亞型Scd1、Scd2、Scd3和Scd4。在水生動(dòng)物中，鯉魚(yú)已知有2種Scd基因亞型[23]，而其他魚(yú)類(lèi)僅含有1種Scd基因(Scd1)[5]。Scd不同亞型對(duì)底物的偏好型不同，能夠與不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸結(jié)合，在特定位置形成雙鍵，其中Scd1負(fù)責(zé)在硬脂酰(18:0)輔酶A中delta-9(C9—C10)位置之間形成雙鍵，合成單不飽和脂肪酸[24-25]。PtScd1 cDNA序列與鯉魚(yú)、團(tuán)頭魴Scd1序列具有較高相似度(>80%)，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)功能具有保守性，表明PtScd1可能參與虎皮魚(yú)單不飽和脂肪酸合成通路[24-25]。

3.2 虎皮魚(yú)PtSCD1蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

PtSCD1蛋白含有326個(gè)氨基酸，其中第33～311位氨基酸為脂肪酸去飽和酶保守結(jié)構(gòu)域，形成口袋狀的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與硬脂酰輔酶A結(jié)合，催化后者形成雙鍵(delta-9)。脂肪酸雙鍵影響含脂質(zhì)的性質(zhì)和功能。如磷脂中脂肪酸雙鍵的數(shù)量和位置決定了細(xì)胞膜的理化性質(zhì)[26]：含有不飽和脂肪酸的磷脂具有更低的相變溫度，促進(jìn)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)序液相狀態(tài)[27-28]，細(xì)胞膜相變對(duì)維持細(xì)胞正常功能具有重要意義[29]。

引入雙鍵的反應(yīng)具有高度特異性，哺乳動(dòng)物SCD1蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析了其底物偏好性和引入雙鍵位置(delta-9)的決定機(jī)制。人類(lèi)和小鼠SCD1蛋白呈錐形體，含有4個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)狹窄的口袋結(jié)構(gòu)與底物結(jié)合[30-31]。該底物結(jié)合口袋內(nèi)部為疏水結(jié)構(gòu)，在結(jié)合硬脂酰輔酶A?；湹腃9和C10位置形成銳利的尖角。底物結(jié)合位點(diǎn)表面帶正電荷，特異性識(shí)別帶有磷酸基團(tuán)的輔酶A，并對(duì)其?；溄Y(jié)構(gòu)進(jìn)行重組。因此推測(cè)，SCD1口袋結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別引入雙鍵的位置(delta-9)。

三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)PtSCD1蛋白有2個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，這一結(jié)論是由Swiss-model蛋白質(zhì)模型預(yù)測(cè)的原理決定的，模型預(yù)測(cè)過(guò)程中，根據(jù)氨基酸序列的相似性，極大地參考了已經(jīng)公布的人和小鼠SCD1蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。雖然在人和小鼠SCD1晶體結(jié)構(gòu)中檢測(cè)到2個(gè)鋅離子，但科學(xué)家認(rèn)為這是蛋白質(zhì)過(guò)表達(dá)所致[30-31]，并預(yù)測(cè)天然SCD1蛋白與鐵離子而非鋅離子結(jié)合。這是因?yàn)椋?1)鋅離子通常為四面體配位，而SCD1的離子結(jié)合位點(diǎn)為八面體，鐵離子正是典型的八面體配位；(2)亞鐵離子(0.92 ?)和鋅離子(0.88 ?)的離子半徑相近；(3)雙鐵離子結(jié)合位點(diǎn)在delta-9硬脂?；d體蛋白(ACP)去飽和酶等氧化酶中有廣泛研究[32]。SCD1蛋白與鋅離子的錯(cuò)配結(jié)構(gòu)導(dǎo)致純化到的SCD1蛋白不具有生物活性。最近有研究將小鼠SCD1晶體結(jié)構(gòu)中的鋅離子去除，重新加入2個(gè)亞鐵離子，發(fā)現(xiàn)SCD1蛋白結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的變化[33]。

基于此，筆者認(rèn)為，虎皮魚(yú)PtSCD1蛋白的保守組氨酸殘基和精氨酸殘基，在靠近底物結(jié)合口袋的尖角處，形成了雙鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，而非鋅離子結(jié)合位點(diǎn)。

3.3 低溫脅迫下虎皮魚(yú)PtScd1轉(zhuǎn)錄本表達(dá)特征

哺乳動(dòng)物Scd1基因表達(dá)具有組織廣泛性，在肝、腎、脾、心臟、脂肪組織、乳腺組織、皮膚、哈德腺等組織均有分布。在水生動(dòng)物中，Scd1基因也在多個(gè)組織表達(dá)。斑馬魚(yú)[8]、遮目魚(yú)[10,34]在身體各個(gè)組織均能檢測(cè)到該基因表達(dá)，草魚(yú)各個(gè)組織也檢測(cè)到Scd1基因表達(dá)，但是在肝臟中表達(dá)量最高，而在腦中表達(dá)量很低[35]。鯉魚(yú)[23]、羅非魚(yú)[1]體內(nèi)Scd1基因僅在肝組織表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，PtScd1轉(zhuǎn)錄本在虎皮魚(yú)腦、鰓、肝臟和肌肉組織均有表達(dá)，且在肝臟中表達(dá)量最高，其次是腦和肌肉組織，在鰓中表達(dá)量最低。不同物種間的表達(dá)譜差異可能是物種特異性調(diào)控機(jī)制引起的[8]，反映了不同物種在適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中對(duì)PtScd1基因的不同依賴(lài)程度[34,36]。本底表達(dá)水平的組織差異性與各組織的生物學(xué)功能有關(guān)，肝臟是魚(yú)類(lèi)脂肪合成的主要場(chǎng)所，在魚(yú)類(lèi)脂代謝過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，PtScd1基因在肝臟組織的高表達(dá)可能與肝臟參與調(diào)控脂肪酸合成和代謝有關(guān)[37]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，Scd1基因在魚(yú)類(lèi)應(yīng)對(duì)低溫脅迫的過(guò)程中具有關(guān)鍵作用：草魚(yú)肝臟中Scd1轉(zhuǎn)錄本豐度在15 ℃處理21 d后開(kāi)始上升[10]；尼羅羅非魚(yú)冷誘導(dǎo)7 d后Scd1轉(zhuǎn)錄本豐度上升了16倍[38]；鯉魚(yú)由30 ℃逐漸降至10 ℃后，Scd1轉(zhuǎn)錄本豐度上升了8～10倍[7]；大黃魚(yú)最適生長(zhǎng)溫度為15 ℃，當(dāng)溫度降至7 ℃時(shí)，肝臟和大腦中Scd1轉(zhuǎn)錄本豐度顯著上升[15]。本試驗(yàn)在腦、鰓、肝臟和肌肉組織中都檢測(cè)到，隨著溫度降低Scd1轉(zhuǎn)錄本豐度顯著上升的現(xiàn)象；特別值得注意的是，在一定范圍內(nèi)腦組織Scd1轉(zhuǎn)錄本相對(duì)豐度與溫度呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，表明腦PtScd1具有作為響應(yīng)低溫脅迫分子標(biāo)志物的潛能。其中，肝臟PtScd1轉(zhuǎn)錄本本底表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他組織，但是低溫脅迫時(shí)的誘導(dǎo)程度低于其他組織，這可能是由于：一方面研究結(jié)果采用相對(duì)定量分析，考慮到肝臟PtScd1轉(zhuǎn)錄本高本底表達(dá)水平，低溫脅迫下相對(duì)表達(dá)水平小幅度上升即意味著PtScd1轉(zhuǎn)錄本絕對(duì)含量大幅增加；另一方面 PtScd1轉(zhuǎn)錄本的組織特異性誘導(dǎo)表達(dá)可能與不同組織的特異性調(diào)控機(jī)制有關(guān)[34]。

低溫下活性Scd1表達(dá)水平上升，不飽和脂肪酸比例增加，細(xì)胞膜保持一定的流動(dòng)性，從而使魚(yú)類(lèi)低溫耐受能力增強(qiáng)[3]。研究證實(shí)，提高羅非魚(yú)Scd1轉(zhuǎn)錄本含量和活性，羅非魚(yú)低溫耐受能力相應(yīng)提高[17]。另一方面，微粒體中Scd1的降解速率非?？?，半衰期僅數(shù)小時(shí)[39]，機(jī)體可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控[40]，從而快速、精準(zhǔn)響應(yīng)環(huán)境脅迫。因此，預(yù)測(cè)PtScd1基因可能在虎皮魚(yú)應(yīng)對(duì)脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)RACE克隆和序列拼接獲得虎皮魚(yú)Scd1(PtScd1)cDNA序列，預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框序列包含981個(gè)核苷酸，編碼326個(gè)氨基酸；氨基酸序列含有高度保守的脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)存在雙鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，可結(jié)合底物硬脂酰輔酶A和(Z)-十八碳-9-羥基-(2R)-2,3-二氧氮自由基丙酸，在脂肪酸delta-9位置引物雙鍵，催化生成單不飽和脂肪酸。qPCR技術(shù)檢測(cè)到PtScd1轉(zhuǎn)錄本在虎皮魚(yú)腦、鰓、肝臟和肌肉組織中表達(dá)，其中肝臟表達(dá)水平最高；低溫誘導(dǎo)虎皮魚(yú)PtScd1轉(zhuǎn)錄本豐度上升，腦組織PtScd1轉(zhuǎn)錄本相對(duì)表達(dá)水平與溫度具有顯著負(fù)相關(guān)性。預(yù)測(cè)PtScd1基因可能作為在虎皮魚(yú)應(yīng)對(duì)低溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究結(jié)果將為提高虎皮魚(yú)低溫存活率提供理論依據(jù)。