馬本賀，陶志英，吳早保，吳 斌，王海華，徐先棟，陳翠云

( 1.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039; 2.鷹潭市漁業(yè)漁政局，江西 鷹潭 335000; 3.余江縣宏鑫特種水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，江西 鷹潭 335200 )

我國(guó)泥鰍養(yǎng)殖品種主要有大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)2種，前者生長(zhǎng)速度較快、抗病力強(qiáng)，后者口感較好且懷卵量多[1]。2012年以來(lái)，臺(tái)灣泥鰍(P.dabryanusssp. Taiwan)引入我國(guó)大陸地區(qū)養(yǎng)殖，迅速獲得大面積推廣。研究表明，就品種分類而言，臺(tái)灣泥鰍為大鱗副泥鰍的一個(gè)地方性種群[2]，未達(dá)到種的分化。體色是魚類重要的表型特征，也是評(píng)價(jià)其商品價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)格的重要指標(biāo)，魚類的體色主要由遺傳、生理、環(huán)境等因素決定[3-4]。2014年，本研究團(tuán)隊(duì)在大鱗副泥鰍養(yǎng)殖群體中發(fā)現(xiàn)極少量體表呈金紅色的變異個(gè)體，將其選出后以紅體色為目標(biāo)性狀，通過(guò)定向交配和人工選育，目前已獲得紅色性狀穩(wěn)定遺傳的群體，暫命名為“贛紅1號(hào)”品系(以下簡(jiǎn)稱“贛紅1號(hào)”)(圖1)，其肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，體色金紅、泳姿綽約，兼具食用和觀賞價(jià)值，深受消費(fèi)者青睞。

魚類的早期發(fā)育研究是水產(chǎn)養(yǎng)殖種苗繁育的基礎(chǔ)之一，我國(guó)學(xué)者對(duì)鰍科魚類的早期發(fā)育已有研究。如邱楚雯等[5]觀察了臺(tái)灣泥鰍的早期發(fā)育過(guò)程；杜啟艷等[6]對(duì)豫北地區(qū)大鱗副泥鰍的胚胎發(fā)育進(jìn)行了觀察；劉自然等[7]探究了溫度對(duì)泥鰍胚胎卵裂間隔時(shí)間的影響。目前，針對(duì)體色變異的泥鰍發(fā)育生物學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，筆者通過(guò)收集性成熟的“贛紅1號(hào)”個(gè)體進(jìn)行人工繁殖試驗(yàn)，觀察并分析其胚胎發(fā)育過(guò)程，旨在探究大鱗副泥鰍新品系的胚胎發(fā)育規(guī)律，為提高其人工繁殖的受精率和孵化率提供關(guān)鍵參數(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)親魚：親本雌鰍來(lái)自余江縣宏鑫特種水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，腹部膨大柔軟有彈性，平均體長(zhǎng)(17.23±1.45) cm，體質(zhì)量(56.92±3.23) g；雄鰍來(lái)自江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，體型勻稱，背部后方兩側(cè)脊條明顯，平均體長(zhǎng)(18.50±1.51) cm，體質(zhì)量(42.30±2.86) g，試驗(yàn)在江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所泥鰍黃鱔科研試驗(yàn)基地進(jìn)行。

催產(chǎn)藥物：絨毛膜促性腺激素(HCG)和促黃體素釋放激素A2(LHRH-A2)為寧波第二激素廠生產(chǎn)，地歐酮(DOM)為寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn)。

圖1 “贛紅1號(hào)”親本Fig.1 The brookstocks of loach “Ganhong No.1”

試驗(yàn)物品及器材：黃泥塊，80目過(guò)濾網(wǎng)，塑料盆，鵝毛，生理鹽水，孵化桶，孵化網(wǎng)箱，氣泵，光學(xué)生物顯微鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工繁殖

人工催產(chǎn)：催產(chǎn)藥物濃度及含量為絨毛膜促性腺激素500 IU/mL、促黃體素釋放激素A28.33 mg/mL、地歐酮3.33 mg/mL，注射量為雌鰍0.2 mL/尾、雄鰍0.1 mL/尾。泥鰍經(jīng)麻醉后用潤(rùn)濕的毛巾擦干體表水分和黏液，左手穿戴干凈棉質(zhì)手套固定住泥鰍。采取背部肌肉注射藥物的方法，右手執(zhí)注射器，從背鰭基部?jī)蓚?cè)肌肉較多處向下與魚體呈30°～45°的方向刺入0.3～0.5 cm，迅速注入藥液。

人工授精及孵化：使用壓腹擠卵、壓腹擠精的方式進(jìn)行半干法授精，受精完成后，采取孵化桶和網(wǎng)箱兩種孵化方式。孵化桶孵化前先將受精卵人工脫黏，孵化桶保持循環(huán)流水，微孔氣石增氧。網(wǎng)箱孵化時(shí)受精卵未經(jīng)脫黏，清洗后直接用鵝毛刷蘸取均勻潑灑到懸浮于孵化池的網(wǎng)箱中，受精卵利用自身黏性粘附在網(wǎng)箱底部的網(wǎng)片上，進(jìn)行靜水增氧孵化。

1.2.2 取樣和觀察

取樣時(shí)用玻璃培養(yǎng)皿在孵化桶中撈取適量受精卵，取樣頻率為卵裂至囊胚階段10 min/次，原腸至出膜階段30 min/次，每次隨機(jī)取樣受精卵不少于30粒，觀察并記錄胚胎各時(shí)期的發(fā)育時(shí)間和形態(tài)特征，以50%以上的個(gè)體發(fā)育到某階段作為該階段的起始時(shí)間。觀察、拍攝均在光學(xué)生物顯微鏡下進(jìn)行，使用ToupCam顯微數(shù)字相機(jī)(杭州圖譜光電科技有限公司)和Algae C浮游生物計(jì)數(shù)分析智能鑒定系統(tǒng)(杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司)進(jìn)行圖片的拍照及處理。

2 結(jié) 果

2.1 人工繁殖

2018年5月24日—6月4日進(jìn)行3個(gè)批次人工繁殖試驗(yàn)，共催產(chǎn)雌鰍80尾、雄鰍19尾，在(26.0±1.0) ℃水溫下平均效應(yīng)時(shí)間14.7 h，催產(chǎn)率(93.43±2.20)%，受精率(76.67±2.89)%，孵化率(72.33±5.51)%，獲得水花苗28.9萬(wàn)尾(表1)。

2.2 胚胎發(fā)育

“贛紅1號(hào)”的成熟卵子為金黃色圓形，屬于端黃卵中的富質(zhì)卵，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，極性不明顯，平均質(zhì)量為343.6 μg/粒。受精卵為具有黏性的沉性卵，平均膜徑1052.49 μm。在受精卵和質(zhì)膜之間有一層均勻的卵周間隙，平均厚度為72.32 μm(圖2a)。按照一般硬骨魚的胚胎階段劃分方法[8-9]，受精卵在水溫(26.9±0.8) ℃、溶解氧≥8.25 mg/L、pH 8.2環(huán)境下，經(jīng)歷7個(gè)階段29個(gè)時(shí)期，歷時(shí)26.42 h孵化出膜，完成胚胎發(fā)育成為前期仔魚。胚胎發(fā)育過(guò)程及各個(gè)階段主要形態(tài)特征見(jiàn)表2。

2.2.1 胚盤形成

受精后卵周間隙逐漸擴(kuò)大，約0.57 h后原生質(zhì)集中于動(dòng)物極形成隆起狀半透明的胚盤(圖2b)。

2.2.2 卵裂

“贛紅1號(hào)”的卵裂方式為不完全卵裂中的盤狀卵裂。受精后0.93 h，動(dòng)物極出現(xiàn)1道卵裂溝，將胚盤從中間分開(kāi)，經(jīng)裂形成2個(gè)大小相等的分裂球，進(jìn)入2細(xì)胞期(圖2c)。受精后1.23 h，形成第2個(gè)卵裂溝，第2次分裂形成“2×2”排列的4個(gè)形狀相似的分裂球，進(jìn)入4細(xì)胞期(圖2d)。受精后1.62 h，胚盤同時(shí)形成2個(gè)平行的卵裂溝，進(jìn)行第3次分裂，形成“2×4”排列的8個(gè)分裂球，進(jìn)入8細(xì)胞期(圖2e)。受精后1.92 h，同時(shí)形成2個(gè)卵裂溝進(jìn)行

表1 “贛紅1號(hào)”繁殖統(tǒng)計(jì)Tab.1 Spawning statistics of “Ganhong No.1”

圖2 “贛紅1號(hào)”的胚胎發(fā)育Fig.2 Embryonic development of “Ganhong No.1”a.受精卵; b.胚盤形成; c.2細(xì)胞期; d.4細(xì)胞期; e.8細(xì)胞期; f.16細(xì)胞期; g.32細(xì)胞期; h.多細(xì)胞期; i.桑葚期; j.高囊胚期; k.低囊胚期; l.原腸早期; m.原腸中期; n.原腸晚期; o.神經(jīng)胚期; p.胚孔封閉期; q.肌節(jié)期; r.眼基出現(xiàn)期; s.眼囊期; t.尾芽期; u.耳囊期; v.晶體出現(xiàn)期; w.耳石出現(xiàn)期; x.肌肉效應(yīng)期; y.心跳期; z.尾顫期; a1.出膜前期; b1.出膜期; c1.初孵仔魚.a.fertilized egg; b.blastodisc formation; c.2-cell stage; d.4-cell stage; e.8-cell stage; f.16-cell stage; g.32-cell stage; h.multi-cell stage; i.morula; j.high blastula; k.low blastula; l.early gastrula; m.middle gastrula; n.late gastrula; o.neurula；p.closure of blastopore; q.myomere stage; r.eye primordia; s.optic sac; t.tail bud stage; u.auditory vesicle; v.crystal stage; w.appearance of otolith; x.musclar contraction stage; y.heart beating stage; z.tail fibrillation stage; a1.pre-hatching stage; b1.hatching stage; c1.newly hatched larva.

表2 “贛紅1號(hào)”的胚胎發(fā)育Tab.2 Embryonic development of “Ganhong No.1”

第4次分裂，形成“4×4”排列的16個(gè)分裂球，進(jìn)入16細(xì)胞期(圖2f)。受精后2.28 h，胚盤進(jìn)行第5次卵裂，形成32個(gè)分裂球，分裂球開(kāi)始不規(guī)則排列，進(jìn)入32細(xì)胞期(圖2g)。隨著胚盤繼續(xù)卵裂，2.72 h，形成大小不一、界限相對(duì)明顯的多個(gè)分裂球，進(jìn)入多細(xì)胞期(圖2h)。分裂球持續(xù)分裂，細(xì)胞界限開(kāi)始模糊、數(shù)量較多難以計(jì)數(shù)，呈現(xiàn)多層重疊排列，受精后3.20 h，在胚盤處形成桑葚狀的細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)入桑葚期(圖2i)。

2.2.3 囊胚

動(dòng)物極細(xì)胞繼續(xù)分裂，分裂球數(shù)量、層數(shù)進(jìn)一步增多，受精后3.88 h，眾多分裂球組成的囊胚宛若一頂隆起的帽子覆蓋在胚盤上，進(jìn)入高囊胚期(圖2j)。高囊胚后，動(dòng)物極細(xì)胞向植物極移動(dòng)，囊胚高度降低，受精后4.38 h，進(jìn)入低囊胚期(圖2k)。

2.2.4 原腸

囊胚層細(xì)胞向植物極移動(dòng)，胚盤下包，受精后5.43 h，胚環(huán)出現(xiàn)，進(jìn)入原腸早期(圖2l)。胚盤繼續(xù)下包，受精后6.43 h，胚層細(xì)胞包裹卵黃的1/2，胚環(huán)一端隆起形成胚盾，進(jìn)入原腸中期(圖2m)。受精后8.07 h，胚盤下包至卵黃3/4～4/5處，胚盾增長(zhǎng)，胚體雛形出現(xiàn)，進(jìn)入原腸晚期(圖2n)。

2.2.5 神經(jīng)胚

受精后9.72 h，胚環(huán)前端膨大形成頭部，胚體逐漸形成，進(jìn)入神經(jīng)胚期(圖2o)，此時(shí)期出現(xiàn)胚孔，胚體背部形成神經(jīng)板。受精后10.07 h，進(jìn)入胚孔封閉期(圖2p)，胚孔閉合，胚層包住卵黃，神經(jīng)板開(kāi)始內(nèi)凹，尾芽原基出現(xiàn)。

2.2.6 器官形成

胚體繼續(xù)發(fā)育，受精后10.47 h，胚體中部出現(xiàn)3～5對(duì)肌節(jié)，進(jìn)入肌節(jié)期(圖2q)。出現(xiàn)肌節(jié)約0.58 h后，頭部?jī)蓚?cè)出現(xiàn)1對(duì)突起的眼基，為眼基出現(xiàn)期(圖2r)；0.92 h后，眼基發(fā)育成橢圓形的眼囊，進(jìn)入眼囊期(圖2s)，此時(shí)肌節(jié)10～12對(duì)。受精后13.55 h，胚體后端腹面出現(xiàn)尾芽，稱為尾芽期(圖2t)，眼囊中間內(nèi)陷形成視杯，肌節(jié)增加到16對(duì)。受精后15.57 h，胚體頭部后端出現(xiàn)1對(duì)耳囊，稱為耳囊期(圖2u)，尾部開(kāi)始與卵黃分離。受精后16.85 h，在視杯口出現(xiàn)近圓形的晶狀體，稱為晶體出現(xiàn)期(圖2v)。受精后19.58 h，耳囊中出現(xiàn)2顆形狀相似、大小相等的鈣化耳石，進(jìn)入耳石期(圖2w)，此時(shí)尾鰭出現(xiàn)褶皺，胚體前端與卵黃囊連接處形成心臟原基。受精后20.85 h，胚體出現(xiàn)輕微的抽動(dòng)，進(jìn)入肌肉效應(yīng)期(圖2x)，胚體后半部分逐漸與卵黃分離，心臟原基發(fā)育成管狀心臟，周圍出現(xiàn)淺紅色流動(dòng)血液。受精后22.02 h，管狀心臟開(kāi)始有規(guī)律的搏動(dòng)，進(jìn)入心跳期(圖2y)，平均搏動(dòng)頻率54次/min。心跳期持續(xù)1.67 h左右，胚體尾部開(kāi)始不斷無(wú)規(guī)則顫動(dòng)，進(jìn)入尾顫期(圖2z)。

2.2.7 出膜

受精后24.80 h，胚體在卵膜內(nèi)頻繁轉(zhuǎn)動(dòng)，伴隨著尾部的劇烈擺動(dòng)，進(jìn)入出膜前期(圖2a1)。出膜前期持續(xù)約1.25 h，卵膜在尾部的作用下破裂，胚體尾部首先破膜露出，進(jìn)入出膜期(圖2b1)，胚體頭部和卵黃仍在卵膜內(nèi)，卵黃囊前端呈圓球狀，后端為細(xì)長(zhǎng)棒狀。受精后26.42 h，尾部頻繁擺動(dòng)使胚體頭部擺脫卵膜，整個(gè)胚體脫膜而出，成為初孵仔魚(圖2c1)。

初孵仔魚呈黃色半透明狀，肌節(jié)40節(jié)以上且器官清晰可見(jiàn)，平均全長(zhǎng)3193.42 μm，肛前長(zhǎng)2630.53 μm，體高688.69 μm。卵黃囊緊貼魚體，前端由圓球形拉伸成長(zhǎng)橢圓形，平均長(zhǎng)徑844.48 μm，短徑563.20 μm，后端呈細(xì)長(zhǎng)棒狀，平均最寬210.88 μm，長(zhǎng)1352.14 μm。心搏率72～85次/min，周圍淡紅色血液涌動(dòng)明顯。腸管末端與身體近似垂直，消化道未貫通，多沉在水底，偶作不規(guī)則短距離沖游。

3 討 論

3.1 泥鰍人工繁殖方法比較

泥鰍1～2齡即可達(dá)到性成熟，生殖期4—10月均可產(chǎn)卵，養(yǎng)殖生產(chǎn)上以5—6月和9—10月為繁殖旺季，稱之為春繁和秋繁。泥鰍的催產(chǎn)藥物主要是絨毛膜促性腺激素和地歐酮，搭配促黃體素釋放激素A2或鮭魚促性腺激素類似物，用NaCl溶液將藥物稀釋到一定含量混勻后采取背部注射方式進(jìn)行催產(chǎn)。根據(jù)親鰍規(guī)格和發(fā)育情況，親鰍雌雄比、催產(chǎn)藥物的劑量可酌情增減[5,10-14](表3)，一般注射劑量為雌鰍0.2 mL，雄鰍減半。催產(chǎn)后效應(yīng)時(shí)間隨環(huán)境溫度和性腺發(fā)育的不同而有所改變，依據(jù)泥鰍的生物學(xué)特性，效應(yīng)環(huán)境溫度基本保持在20～26 ℃，效應(yīng)時(shí)間11～18 h。受精方式以人工授精為主，雌鰍采取壓腹擠卵的方法，取精方法分為壓腹擠精和剖殺取精2種，剖殺取精的受精率在50%～83%，壓腹擠精受精率69.2%～86%。在雄鰍體質(zhì)健康、性腺發(fā)育良好的情況下，采用壓腹擠精，可以在不降低受精率的前提下降低雄鰍死亡率。采用人工授精方式的臺(tái)灣泥鰍催產(chǎn)率可達(dá)90%以上，而自然交配方式的催產(chǎn)率僅有52%，根據(jù)生產(chǎn)觀察推測(cè)其主要原因是臺(tái)灣泥鰍體型較為粗壯，雌鰍和雄鰍很難完成相互纏繞的交配和受精過(guò)程，導(dǎo)致催產(chǎn)率降低，造成了親魚的浪費(fèi)，而人工授精借用人力排出成熟的卵子和精子并使之混合受精，大大提高了催產(chǎn)率。2種孵化方式相比較，孵化桶孵化雖然操作相對(duì)復(fù)雜，優(yōu)點(diǎn)是受精卵孵化率明顯提高，適合大規(guī)模生產(chǎn)?！摆M紅1號(hào)”是大鱗副泥鰍的體色變異群體，兩者的人工繁殖方法相似，本試驗(yàn)在團(tuán)隊(duì)前期工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，采用親鰍雌雄比5∶1、壓腹擠精、孵化桶孵化的方式時(shí)，既能保持較高的受精和孵化率，又能減少雄鰍損耗，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

3.2 “贛紅1號(hào)”及鰍科魚類胚胎發(fā)育特征

“贛紅1號(hào)”的胚胎發(fā)育經(jīng)歷胚盤形成、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成和出膜7個(gè)階段，與正常大鱗副泥鰍發(fā)育時(shí)序相同?！摆M紅1號(hào)”的成熟卵子整體呈金黃色，大鱗副泥鰍的成熟卵子大多為橙黃色或淺黃色[15]。胚胎發(fā)育至心跳期“贛紅1號(hào)”的心跳搏動(dòng)頻率達(dá)到54次/min，高于臺(tái)灣泥鰍的15次/min[5]。“贛紅1號(hào)”仔魚出膜時(shí)全身無(wú)黑色素，整個(gè)仔魚期體表呈半透明或金黃色，無(wú)明顯的黑色素出現(xiàn)。大鱗副泥鰍仔魚出膜時(shí)軀體或頭部出現(xiàn)少量黑色素[16]，出膜后體表黑色素快速增多，至出膜后約12.5 h時(shí)，眼睛密布黑色素，肌體上下各出現(xiàn)一行黑色素[17]。隨著發(fā)育的進(jìn)行，大鱗副泥鰍仔魚鰭、頭、軀體等部位出現(xiàn)大量黑色素，“贛紅1號(hào)”并無(wú)此現(xiàn)象。二者的差異表明“贛紅1號(hào)”體色是先天形成的，從胚胎出膜期即表現(xiàn)出與正常大鱗副泥鰍的不同。

表3 “贛紅1號(hào)”和臺(tái)灣泥鰍的人工繁殖方式Tab.3 The methods of artificial propagation in “Ganhong No.1” and loach P. dabryanus ssp. in Taiwan, China

按照傳統(tǒng)分類方法將鰍科分為花鰍亞科、條鰍亞科和沙鰍亞科3個(gè)亞科[18]，各亞科鰍類的胚胎發(fā)育劃分階段基本一致，但是其受精卵類型、發(fā)育時(shí)間和初孵仔魚形態(tài)特征有較大差異。由表4可見(jiàn)，“贛紅1號(hào)”和臺(tái)灣泥鰍[5]、大鱗副泥鰍[16]、泥鰍[19]同屬花鰍亞科，受精卵均為沉性卵，具黏性或微黏性，卵徑為900～1210 μm；條鰍亞科的西昌高原鰍(Triplophysaxichangensis)[20]、東方高原鰍(T.orientalis)[21]、秀麗高原鰍(T.venusta)[22]和貝氏高原鰍(T.bleekeri)[23]亦為沉性卵，具有黏性或強(qiáng)黏性，卵徑為1040～1480 μm；沙鰍亞科的中華沙鰍(Botiasuperciliaris)[24]、長(zhǎng)薄鰍(Leptobotiaelongate)[25]和寬體沙鰍(B.reevesae)[26]受精卵則為無(wú)黏性的漂浮卵，卵徑為1750～4790 μm。綜合來(lái)看，沙鰍亞科的受精卵和出孵仔魚均為最大，條鰍亞科次之，花鰍亞科最小。受精卵的大小和初孵仔魚的全長(zhǎng)呈正相關(guān)關(guān)系[27]，“贛紅1號(hào)”的受精卵和初孵仔魚分別為1052 μm和3193 μm，介于臺(tái)灣泥鰍和大鱗副泥鰍之間，而與沙鰍亞科中長(zhǎng)薄鰍受精卵和初孵仔魚的長(zhǎng)度4100 μm和 5200 μm相差甚遠(yuǎn)。

花鰍亞科和沙鰍亞科的胚胎平均孵化溫度高于條鰍亞科，而花鰍亞科和沙鰍亞科的胚胎發(fā)育時(shí)間為26～38 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于條鰍亞科的78～358 h。孵化歷時(shí)越長(zhǎng)，初孵仔魚的器官分化程度越高，“贛紅1號(hào)”胚胎經(jīng)26.42 h發(fā)育后初孵仔魚則通體透明無(wú)黑色素，出膜時(shí)器官發(fā)育程度較低，而貝氏高原鰍胚胎經(jīng)約287 h的發(fā)育，仔魚出膜時(shí)器官發(fā)育程度較高，其口凹和肛門原基、鰓弓、胸鰭等器官原基已經(jīng)形成，眼及身體出現(xiàn)大量黑色素，具備初步的視覺(jué)、運(yùn)動(dòng)能力。可能是因?yàn)楦鱽喛砌q類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和長(zhǎng)期演化過(guò)程中的適應(yīng)性不同[28-29]，或者與溫度[30]、溶解氧[31]等的外部環(huán)境有關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，“贛紅1號(hào)”采用親鰍雌雄比5∶1、壓腹擠精、孵化桶孵化的方式可以達(dá)到良好的人工繁殖效果。其體色與自身遺傳有關(guān)，與正常大鱗副泥鰍比較兩者卵子類型、胚胎發(fā)育時(shí)序均相似。

表4 不同亞科鰍類的受精卵、胚胎發(fā)育和仔魚比較Tab.4 The comparison of fertilized eggs, embryonic development and larvae of loach in different subfamilies