李認(rèn)認(rèn) 朱錦明 王鳳珍

[摘要] 目的 研究熱休克蛋白27（HSP27）在妊娠期高血壓疾病孕婦靜脈血、臍血及胎盤(pán)組織中的表達(dá)及臨床意義。 方法 選取2018年6月—2019年6月于江蘇省徐州市婦幼保健院分娩的妊娠期高血壓疾病孕婦90例[其中妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組和重度子癇前期組，各30例]，同期另收集健康孕婦30例作為對(duì)照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)孕婦靜脈血和臍血中HSP27水平;采用RT-PCR、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胎盤(pán)組織HSP27 mRNA和蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果 對(duì)照組、妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組、重度子癇前期組孕婦靜脈血、臍血中HSP27水平均呈遞增趨勢(shì)，各組之間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。對(duì)照組、妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組、重度子癇前期組胎盤(pán)組織HSP27 mRNA表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。對(duì)照組、妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組、重度子癇前期組胎盤(pán)組織HSP27蛋白表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 妊娠期高血壓疾病孕婦靜脈血、臍血和胎盤(pán)組織中HSP27呈高表達(dá)，且HSP27的表達(dá)與妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，提示HSP27可能參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 妊娠期高血壓疾病;熱休克蛋白27;胎盤(pán);臍血;母血

[中圖分類號(hào)] R714.24+6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）09（c）-0104-04

Expression and clinical significance of heat shock protein 27 in maternal and fetal serum and placenta of patients with hypertensive disorder complicating pregnancy

LI Renren1? ?ZHU Jinming2? ?WANG Fengzhen3

1.Graduate School， Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou? ?221004， China; 2.Department of Obstetrics， Xuzhou Maternal and Child Health Care Hospital， Jiangsu Province， Xuzhou? ?221009， China; 3.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou? ?221006， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of heat shock protein 27 （HSP27） in maternal and fetal serum and placental of patients with hypertensive disorders of pregnancy （HDP）. Methods Ninety pregnant women with gestational hypertension delivered in Xuzhou Maternal and Child Health Hospital in Jiangsu Province from June 2018 to June 2019 were selected （including 30 cases of gestational hypertension group， 30 cases of non severe preeclampsia group and 30 cases of severe preeclampsia group）. Another 30 healthy pregnant women were selected as control group. The levels of HSP27 in venous blood and cord blood of pregnant women were detected by enzyme linked immunosorbent assay， and the expressions of HSP27 mRNA and protein in placenta were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. Results The levels of HSP27 in venous blood and cord blood of pregnant women in control group， gestational hypertension group， preeclampsia （non severe） group and severe preeclampsia group showed an increasing trend， and the differences among all groups were highly statistically significant （P < 0.01）. The expression of HSP27 mRNA in placental tissues of control group， pregnancy induced hypertension group， preeclampsia （non severe） group and severe preeclampsia group showed an increasing trend， and the differences among all groups were statistically significant （P < 0.05）. The expression of HSP27 protein in placental tissues of control group， pregnancy induced hypertension group， preeclampsia （non severe） group and severe preeclampsia group showed an increasing trend， and the differences among all groups were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion HSP27 is highly expressed in venous blood， umbilical blood and placental of pregnant women with HDP， and the expression of HSP27 is correlated with the severity of HDP， suggesting that HSP27 may play a role in the development of HDP.

[Key words] Hypertensive disorders of pregnancy; Heat shock protein 27; Placenta; Umbilical cord blood; Maternal blood

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，在我國(guó)的發(fā)病率為9.4%～10.4%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡或并發(fā)其他疾病的主要原因之一[1]。迄今，妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能為滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮肌層過(guò)淺，子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄不足，造成母體血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而出現(xiàn)臨床癥狀[2-4]。熱休克蛋白27（HSP27）屬熱休克蛋白家族，在細(xì)胞受有害因素刺激（如缺血、缺氧、高溫、寒冷、損傷和感染等）下產(chǎn)生[5-7]，能與錯(cuò)誤折疊的蛋白相結(jié)合，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞功能作用。已有報(bào)道，子癇前期患者胎盤(pán)組織中HSP27表達(dá)較正常孕婦升高[8-9]，然而，孕婦靜脈血、臍血中HSP27是否高表達(dá)，以及HSP27表達(dá)與妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度是否有相關(guān)性，目前還不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)妊娠期高血壓疾病孕婦的靜脈血、臍血和胎盤(pán)組織中HSP27的表達(dá)情況，分析HSP27與妊娠期高血壓疾病的關(guān)系，探討其作為診斷指標(biāo)在妊娠期高血壓疾病中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年6月—2019年6月于江蘇省徐州市婦幼保健院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）分娩的妊娠期高血壓疾病孕婦，按照謝幸等[10]主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版關(guān)于妊娠期高血壓疾病診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)，入選妊娠期高血壓、子癇前期（非重度）、重度子癇前期孕婦為妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組、重度子癇前期組，各30例;另收集健康孕婦30名為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)翁?妊娠期高血壓疾病組符合妊娠期高血壓疾病診斷標(biāo)準(zhǔn);擇期剖宮產(chǎn)終止妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往心、肝、腎，內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾病史;既往慢性高血壓、糖尿病史;胎膜早破;母兒感染。四組孕婦的平均年齡為（31.00±5.94）、（30.33±5.50）、（27.73±4.54）、（30.60±6.38）歲，分娩孕齡為（38.77±0.90）、（38.70±1.06）、（38.77±1.04）、（38.27±0.94）周。四組孕婦的年齡及分娩孕齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，試驗(yàn)方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

所有研究對(duì)象入院次日空腹抽靜脈血4 mL，胎兒娩出后立即抽胎盤(pán)臍血4 mL，靜置30 min，3000 r/min離心10 min，離心半徑13 cm，吸取上層血清，置-80℃冰箱保存，用于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）;胎盤(pán)娩出后，取胎盤(pán)母體面近中央處2塊大小1 cm×1 cm×1 cm組織塊，DEPC水沖洗，1塊置于EP管中，立即液氮冷凍后移至-80℃冰箱保存，用于RT-PCR法;另1塊置于10%的中性甲醛中固定24 h，用于免疫組織化學(xué)法。

1.3 ELISA法檢測(cè)靜脈血和臍血中的HSP27水平

ELISA試劑盒購(gòu)于Wuhan Fine Biotech CO公司，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)胎盤(pán)組織HSP27mRNA表達(dá)水平

RNA快速抽提試劑盒（R401-01）購(gòu)于南京諾唯贊生物科技公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，HSP27上游引物：5′-CAAGGATG-GCGTGGTGGA-3′，下游引物：5′-TCTCGTTGGACTG-CGTGGC-3′;產(chǎn)物片段長(zhǎng)度197 bp。β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作內(nèi)參照，上游引物：5′-GTCAGTGGTGGACC-TGACCT-3′，下游引物：5′-AGGGGAGATTCAGTGTG-GTG-3′;產(chǎn)物片段長(zhǎng)度395 bp。按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，HSP27擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 min;94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。以HSP27與β-actin 的灰度比表示其相對(duì)含量。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胎盤(pán)組織HSP27蛋白的表達(dá)

微波修復(fù)抗原，加一抗（武漢博士德生物工程有限公司）后4℃孵育過(guò)夜，加生物素化二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，光鏡下觀察。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和細(xì)胞染色強(qiáng)度確定HSP27蛋白的表達(dá)水平。采用綜合計(jì)分法進(jìn)行半定量分析[11]，以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)著色或與背景顏色一致的為陰性細(xì)胞;計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%為0分，>5%～25%為1分， >25%～<50%為2分，≥50%為3分;根據(jù)多數(shù)細(xì)胞的著色強(qiáng)度計(jì)算強(qiáng)度得分，無(wú)著色為0分，淺棕褐色為1分，棕褐色為2分，深褐色為3分;兩者相加后，0～1分為陰性“-”，2分為“+”，3～4分為“++”，5～6分為“+++”。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性后，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。等級(jí)資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用擴(kuò)展了的t檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組孕婦靜脈血、臍血中HSP27水平比較

對(duì)照組、妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組、重度子癇前期組孕婦靜脈血、臍血中HSP27水平均呈遞增趨勢(shì)，各組之間差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組胎盤(pán)組織HSP27 mRNA表達(dá)比較

對(duì)照組、妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組、重度子癇前期組胎盤(pán)組織HSP27 mRNA表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，表達(dá)水平分別為0.451±0.037、0.628±0.036、0.943±0.039、1.740±0.082，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.3 各組胎盤(pán)組織HSP27蛋白表達(dá)

對(duì)照組、妊娠期高血壓組、子癇前期（非重度）組、重度子癇前期組胎盤(pán)組織HSP27蛋白表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)，陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.6%、86.7%、93.3%、100.0%，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

3 討論

HSP27為小分子熱休克蛋白，具有分子伴侶樣活性，可阻止變性蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集;穩(wěn)定細(xì)胞骨架;抗氧化應(yīng)激;抑制細(xì)胞凋亡的作用[12-15]。大量研究表明，大量熱休克蛋白在妊娠期高血壓疾病中均有不同程度的升高[12-15]。

本研究結(jié)果顯示，妊娠期高血壓疾病孕婦母血、臍血中HSP27表達(dá)升高，且隨疾病嚴(yán)重程度的增加而升高。母血中HSP27也許并非來(lái)自胎盤(pán)，可能為氧化應(yīng)激胎盤(pán)釋放的胎盤(pán)因子進(jìn)入到母體血液循環(huán)，引起母體的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成母體血管內(nèi)皮損傷，HSP27作為保護(hù)性應(yīng)激蛋白，反應(yīng)性表達(dá)升高，保護(hù)內(nèi)皮組織免受損傷，這與關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的研究一致[16]。妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中HSP27 mRNA和蛋白的表達(dá)均升高，且隨疾病的嚴(yán)重程度呈顯著升高的趨勢(shì)。妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，胎盤(pán)組織中活性氧自由基生成增加、線粒體功能受損[17]。HSP27可通過(guò)提高葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性、增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量，提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[18];HSP27可與細(xì)胞色素C相互作用，抑制pro-caspase-9的激活，還可與pro-caspase-3直接作用，發(fā)揮抗凋亡的作用[19];HSP27還可阻止細(xì)胞膜上的Fas死亡受體與其Fasl結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，HSP27在妊娠期高血壓疾病中的表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示HSP27可能參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生。母血中HSP27表達(dá)隨疾病嚴(yán)重程度增加而升高，其可作為早期診斷及疾病嚴(yán)重程度的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一;進(jìn)一步研究如何增加HSP27對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的保護(hù)功能，有望今后對(duì)妊娠期高血壓疾病的防治提供新的治療策略。

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（收稿日期：2020-03-01）