米運宏，梁 鵬，藍伯廣

(1南寧縱聯科技有限公司，廣西南寧530033；2廣西本草坊保健品有限公司，廣西南寧530007)

0 引言

蔗糖酶(Sucrase)[1]也稱蔗糖轉化酶(invertase)[2]或 β-D-呋喃果糖苷水解酶(β-D-fructofuranoside fructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特異地催化非還原糖中的β-D-呋喃果糖苷鍵水解，能催化蔗糖水解生成等量葡萄糖和果糖[3]，稱之為轉化糖漿[4]。蔗糖水解成果糖和葡萄糖可以通過酸水解[5]或蔗糖酶水解[6]。酸水解需要添加酸性物質如檸檬酸鈉、鹽酸、硫酸等至蔗糖溶液中使pH值降至2～3，再經過高溫保壓使蔗糖水解。在高溫高壓下蔗糖水解成果糖和葡萄糖，同時糖也發(fā)生美拉德反應，導致轉化糖液色澤較深，在后工序中需要增加脫色、脫鹽、濃縮等工藝。雖然酸水解中時間較短，但是從整個生產來說時間并沒有縮短，反而造成生產操作復雜化等不足。因此，在實際生產中用蔗糖酶液或凍干蔗糖酶，兩者均為游離酶，游離蔗糖酶用于轉化蔗糖反應結束后需要要滅酶，且僅能用1次，而把游離蔗糖酶固定于特定載體中獲得固定化蔗糖酶[7-8]，用于轉化蔗糖反應完全只需把固定化蔗糖酶回收，不用滅酶，因此，固定化蔗糖酶可重復使用，直至固定化蔗糖酶活性降低到不再適合使用為止[9]。蔗糖(白砂糖)是歷史悠久的最常用的甜味劑之一[10]，清甜純正，無不良感或甜膩感。白砂糖主要以結晶體形式在市場上銷售，除了保存和運輸方便外，使用中存在許多不便，日常烹飪中添加白砂糖調節(jié)菜品的口味或色澤，溶解時間長、著色不均、局部容易焦化等不足，白砂糖以調甜味加到如奶茶、涼茶不容易溶解，在飲料工廠加入白砂糖需要加熱攪拌溶解，增加了能耗等。此外，目前使用玉米源高果糖漿存在對人體健康的風險[11]，為為了克服白砂糖此類使用不足和滿足市場細細分需要，市場上出現月餅專用標準糖漿(燒烤糖漿、 烹 飪 糖漿、奶茶專用糖漿、調味糖漿)[12-13]、甘 蔗 糖漿[14-15]、冰糖漿等等，而此類糖漿含有一定量的蔗糖成分，不能完全用淀粉糖漿如玉米源高果糖漿[16-17]、麥芽糖漿代替。但蔗糖源高果糖漿銷售價格比淀粉源果葡糖漿貴將近一倍。除了生產原料白砂糖價格高之外，生產成本高也導致致蔗糖源高果糖漿價格偏高。為了提高蔗糖源果葡糖漿競爭力，利用固定化蔗糖酶法生產蔗糖源果葡糖漿對降低產品成本效果顯著，且優(yōu)點明顯：首先工藝上減少滅酶、脫色能耗；其次固定化蔗糖酶可重復使用，減少酶的的成本；最后是產品質量比較純凈、、保持產品色香味、甜度增厚，不容易結晶[18]。而固定化蔗糖酶生產蔗糖源果葡葡糖漿的關鍵是蔗糖酶固定化技術[19]和固定化蔗糖酶轉化蔗糖[20]的控制參數，本文主要介紹固定化蔗糖酶轉化蔗糖生產蔗糖源果葡糖漿的控控制參數的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

優(yōu)質白砂糖(南南寧糖業(yè)明 陽糖廠)、乙腈腈(色譜純，天津四友)、固定化化蔗糖酶(自制，活力為2..5萬U/g)、試驗反應罐(OK-10 L，浙江新歐科)，驗證試驗反應罐(TR08-1000 L，江蘇天宇)、板框過濾機((WBG-1200 mm，廣州恒東機械)，超高溫瞬時滅菌器(RD 6L10，北京東方海川)、二效真空濃縮器(SJN-100000，溫州成東藥機)、直線灌裝機(GTL--4，山東青州膏體達)、反滲透純水機(HCC-1000，北京京東方海川)、高效液相色譜儀(LA100，日本島津,示差檢測器)、工作站(N20000，浙江大學)、旋振分離篩(TS-12000，河南新鄉(xiāng)天豐振動機械)。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程[21--23]

固定化蔗糖酶法制備蔗糖源高果糖漿的工藝流程見圖1。

圖1 固定化蔗糖酶法制備蔗糖源高果糖漿工藝流程圖

1.2.2 反應設備技技術參數

單因素試驗驗設備采用1000 L不銹鋼反應罐，徑高比為為5/9，葉片式攪拌漿，攪拌不可調轉速為1200 r/minn，夾套導熱油保溫，溫度差可控±0.5℃，反應裝料量為75 L；驗證試驗設備采用10000 L不銹鋼反反應罐，徑高比 55/9，葉片式攪拌漿，攪拌變頻調速120 r/mmin，夾套保溫，溫差可控±0.5℃，，反應加料量為7750 L。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.11 固定化酶用量對轉化率的影響

固定化蔗糖酶用量分別為0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%，溫度50℃，pH 5.0，底物濃度(蔗糖液濃度)50%，反應時間8 h進行試驗。

1.2.3.2 溫度變化對轉化率影響

反應溫度分別為 40、45、50、55、60、65、70、75、80℃，pH 5.0，底物濃度50%，反應時間8 h，固定化酶用量0.25%進行試驗。

1.2.3.3 pH變化對轉化率影響

反應pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，溫度50℃，底物濃度50%，反應時間8 h,固定化蔗糖酶用量0.25%進行試驗。

1.2.3.4 反應底物濃度變化對轉化率影響

底物濃度分別為45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%，其它影響因素溫度50℃，pH 5.0，固定化蔗糖酶用量0.25%，反應時間8 h進行試驗。

1.2.3.5 反應時間變化對轉化率影響

反應時間為 4、6、8、10、12、14、16、18 h，溫度50℃，pH 5.0，底物濃度50%，固定化蔗糖酶用量0.25%進行試驗。

1.2.4 響應面試驗

利用Design-Expert 7.0中軟件Box-Behnken設計與分析，根據單因素試驗結果確定固定化蔗糖酶添加量(A)、反應溫度(B)、pH(C)、反應底物濃度(D)、反應時間(E)為因素水平取值范圍，并以這5個因素為自變量，以轉化率R1為響應值，利用Box-Behnken模型設計5因素3水平試驗組作響應面分析，因素水平值見表1。

表1 試驗因素及水平值

1.2.5 轉化率計算

式 1中葡萄糖(G)、果糖(F)和蔗糖(GF)是指反應轉化結束后的轉化液用高效液相測得的數據。試驗試劑和檢測方法按中華人民共和國國家標準GB/T 20882-2007《果葡糖漿》規(guī)定方法[24-25]。

1.2.6 驗證方法

每次反應驗證都用同一批次新的固定化蔗糖酶，其它控制反應參數經過優(yōu)化獲得的數據。反應結束把固定化蔗糖酶回收，反應液經過瞬時滅菌后，取樣用高效液相色譜儀檢測轉化率。

1.2.7 數據處理

按要求所得的數據，運用軟件Design-Expert 7.0進行模型設計和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 固定化酶用量對轉化率影響

固定化蔗糖酶用量對轉化率的影響見圖2。由圖2可以看出，在反應時間、pH、底物濃度、溫度不變，改變添加固定化蔗糖酶的用量，隨添加量增加，轉化率隨之快速提高，從酶用量0.1%時轉化率為83%，到0.15%時轉化率94%幾乎是直線上升，從 0.15%～0.2%轉化率升高有所放緩，轉化率從94%升至97%，只升高3%，0.2%～0.3%緩慢上升，酶用量到 0.3%～0.4%時轉化率只升高 0.4%。添加量為 0.4%以上時，轉化率升高 1%以下。從經濟角度考慮，酶添加量應該選用0.3%～0.4%之間比較合理。

2.1.2 反應溫度對轉化率的影響

溫度變化是生物酶反應最主要因素之一，在酶耐受溫度內，溫度每變化10℃，酶反應速率提高1～3倍，具體試驗見圖3。

從圖3看出，反應溫度40～60℃轉化率處于上升階段，40～50℃轉化上升較快從76%快速升96%，而反應溫度50～60℃，轉化率從96%升到99.7%。反應溫度超過60℃轉化率開始下降，溫度在60～65℃轉化率下降緩慢，超過溫度65℃轉化率有了較快下降，反應溫度在75～80℃轉化率急速下降，轉化率從86%快速降到53%。反應溫度在隨溫度升高，酶反應開始向最適溫度靠近，所以轉化率在上升階段，當反應溫度升到60℃左右，轉化率最高說明接近最適適反應溫度，溫度繼續(xù)升高，轉化率開始下降，說明反反應溫度超過酶解最適反應溫度，超過溫度越高，轉化率下降越快，高溫對酶活性有抑制或殺滅。圖3可看出固定化蔗糖酶對溫度是敏感的，生產上考慮選取的反應溫度應該在55～65℃。

2.1.3 反應pH值對轉化率的影響

圖2 固定化蔗糖酶不同用量對轉化率的影響

圖3 不同反應溫度對轉化率影響

考查固定化蔗糖酶轉化化蔗糖受到反應系統 pH變化對反應影響情況結果見圖4。

圖4在pH 33.5時轉化率率79%，一直直平緩上升至至pH 55.5，轉化率99.8%，當pH值繼續(xù)升升高至6.5，轉化率率降到83%%，pH值越高，轉化率下降幅度較大，，當pH升至8轉化率僅為41%。從曲線圖4可得pH在5～～5.5區(qū)間為最適反應pH值，pH 3.5～5.5為酸酸性區(qū)，pH值高于5.5之后，轉化率下降比較快，pH為7中性時轉化率為74%，很明顯固定定化蔗糖酶具有耐低pH值，綜合考慮選取反應pH在5～6區(qū)間。

2.1.4 反應底物濃濃度對轉化率率的影響

固定化蔗糖酶轉化蔗糖中僅改變蔗糖濃度，其它因素為溫度 500℃，pH 5..0 固定化蔗糖酶用量0.25%，反應時間8 h影響情況見圖5。

從從圖5中可以看出蔗糖濃度在 50%%轉化率為99.8%，到蔗糖濃度為70%時轉化率為877.5%，蔗糖濃度超過70%時，固定蔗糖酶酶轉化率開始始呈快速下降趨勢，蔗糖濃度75%時轉化化率70%，蔗糖濃度為85%，轉化率為 334%。轉化率隨蔗糖濃度升高，轉化率隨之下降，是由于蔗糖濃度升高，反應體系中的黏度也升高，進而影響了酶分子運動，導致酶解反應速度變慢。從能耗大小考慮，應該選擇底物濃度在65%～75%之間。

2.1.5 反應時間對轉化率的影響

圖4 不同反應pH值對轉化率的影響

圖5 反應底物不同濃度對轉化率的影響

反應溫度 50℃、pH 55.0 固定化蔗糖酶用量0.25%，反應液中蔗糖濃度50%，反應時間為4、6、8、10、12、14、16、18 h試驗結果見圖6。

從圖6看出反應時間4～8 h轉化率曲線很陡，，之后一直平穩(wěn)。說明 4～8 h反應還沒有轉化完全，故轉化率一直上升階段。8～18 h轉化率變化不大，說明反應已經達到或處于平衡階段。酶促促反應時間應選在在 8～12 h。

2.2 響應面面優(yōu)化

2.2.1 響應應面優(yōu)化試驗

利用BBox-Behnkeen模型設計試驗組作響應面分析，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

由表3可看出模型極顯著(P＜0.0001)，說明5個因素變量與轉化率之間的線性關關系顯著。失擬合項P=0.0942＞0.05，不顯著，說明本試驗所得得二次回歸方程能能很好地對響響應值進行預預測。試驗值值與回歸方程預測值的相關系數R2為0.99798，說明該該模型能解釋97.98%響應值的的變化，只有有2.12%不能能用此模型解釋，擬合情況很很好。校正擬合度AdjjR2為0.9637和預測擬合度PrredR2為0.9230，兩者數數字相近且數值較大接近 1，說明該模型型具有較好的的回歸性。變異系數數(CV)表示試試驗的精確度度，其數值越越小，試驗結果的可靠性越高高。

圖6 不不同反應時間對對轉化率的影響

表2 響應面試驗驗設計與結果

試驗號 酶用量(%) 反應溫度(℃) pH 底物濃度(%) 反應時間(h) 轉化率(%)33 -1 0 0 1 0 87.5 34 0 0 0 0 0 96.8 35 0 0 0 0 0 97.1 36 0 0 1 0 1 96.9 37 1 0 0 1 0 90.2 38 1 -1 0 0 0 98.1 39 0 0 -1 -1 0 98 40 0 -1 0 0 -1 97.2 41 0 0 0 0 0 97.7 42 0 1 1 0 0 97.4 43 -1 1 0 0 0 96.8 44 -1 0 -1 0 0 95.9 45 1 0 0 0 -1 97.6 46 0 1 0 -1 0 96.3

表3 響應值模型方差分析

本試驗 CV為 0.76%，在可接受范圍內說明試驗結果可靠很高[26-27]。從回歸方程系數顯著性可知，一次項A、D、E極顯著，互交項 BD及二次項D2表現為顯著。由F值大小可得出各因數影響大小，依次為底物濃度(D)＞添加酶量(A)＞反應時間(E)＞反應溫度(B)＞pH(C)。經回歸擬合后得到二次多項式編碼回歸方程：轉化率(%)(Y)=97.37+0.97A+0.26B-0.25C-4.79D+0.49E-0.40AB+0.20AC+0.35AD+0.12AE+0.23BC+0.78BD-0.17BE-0.27CD-0.70CE+0×DE+0.25A2-0.31B2-0.36C2-4.82D2-0.11E2。

圖7是BD互交項為顯著項的所得到的二次回歸方程的R1響應面3D圖。圖底部等高線及曲面形狀反映交互作用大小，當為橢圓形時，表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著[28]。

2.3 響應面面優(yōu)化最佳控控制參數

經過軟軟件分析，設設置軟件響應值(轉化率率)達到最大化(maaximize)[29]，模型運行預測得到最佳控制參數：酶用量0.4%，反應溫度588.36℃，pH5.13，底物濃度66.9%，反應應時間12.82 h。響應面法優(yōu)化結果見圖8～10三維效果圖。

圖8～10是在最佳條件的情況下，影響最大因素底物濃度和影響第2位因素的3D效果圖，由圖可見等高線互交作用顯著，響應曲面的傾斜度較高，顏色也由淺藍色漸變深綠色，說明交互作用顯著。

圖7 互交項BD響應面三維圖

圖8 最佳條件下下BD互交項轉化率3D效果和等高線圖

圖9 最佳條件AD互交項3D效果和等高線圖

圖10 最佳條件下BD互交項3D效果和等高線圖

2.4 模模型驗證

根據優(yōu)化得到操作參數：添加酶量(A)0.4%，反應溫度(B)58.36℃℃，pH(C)5.13，底物濃度(D)66.9%，反應時間(E)13.115 h，按實際操作修改為添加酶量(A)0.4%，反應溫度(B)58.4℃℃，pH(C)5.11，底物濃度(D)677%，反應時間(E)13 h。驗證檢測結果可見圖11～13。

由表4～6可以看出反應液中果糖、、葡萄糖、蔗糖含量，表4果糖、、葡萄糖、蔗糖糖含量分別為49.61%、48.34%%，2.05%，由此可計算出第一次驗證的轉化率為97..95%；表5果糖、葡萄糖、蔗糖含量為別為51.43%、47.19%，1.38%，計計算出第 2次次驗證的轉化率為為98.62%；表6果糖、葡萄糖、蔗糖含量為別為50.44%、48.20%，1.36%，計算得第3次驗證的轉化率為98.65%；；平均轉化率為98.41%，與軟件預測轉化化率接近，說明模型預測可靠。

圖11 第一次驗證反應分離液的高效液相譜圖

圖12 第二次驗證反應分離液的高效液相譜圖

圖13 第三次驗證反應分離液的高效液相譜圖

表4 第一次驗證反應分離液的高效液相峰面積分結果

表5 第二次驗證反應分離液的高效液相峰面積積分結果

表6 第三次驗證反應分離液的高效液相峰面積積分結果

3 結論與展望

⑴通過優(yōu)化試驗，得到固定化蔗糖酶轉化蔗糖最佳控制參數：酶用量 0.4%，反應溫度 58.36℃，pH 5.13，底物濃度66.9%，反應時間12.82 h，并可應用到實際生產中酶解工序中。

⑵蔗糖源高果糖漿是專用標準糖漿，可根據用戶的需要糖漿中各糖分含量的比例，通過控制轉化反應參數加以實現，企業(yè)可從傳統產品統一標準生產方式轉向定制式生產模式。

⑶實際生產中所考慮的最主要因素之一是經濟效益，按生產工藝過濾、滅菌、濃縮等重要工序，初步制得固形物為70%的成品，按白砂糖價格6000元/t計算，把能源費、人工費、包裝費等費用計算在內，測算直接生產成本約5400元/t，而淀粉源高果糖漿的市場價格在3000元/t左右。為蔗糖源高果糖漿產品贏得市場競爭，把蔗糖源高果糖漿進一步升級，與其它食品配料因子復配成各類調味糖漿、調甜糖漿、專用糖漿等，另外，從原料上可以選用冰糖母液、制高純度低聚果糖副產物、甘蔗汁等為原料，把蔗糖源高果糖漿的成本進一步降低，提高產品競爭力。

⑷生產工藝的各關鍵控制點進行研究分析，重點將是把各項工序中控制參數納入研究分析體系，然后選擇合適分析方法，獲得制備蔗糖源高果糖漿最高經濟收益的全部生產工藝參數。